Лабораторная работа по иммунологии микрофлора кожи. Практикум по микробиологии

Департамент образования города Москвы

Технологический колледж №28

Жукова Л.А.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

Для учащихся профессии НПО

Москва

2012

«Основы микробиологии, санитарии и гигиены»

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

для учащихся профессии НПО

34.17 Оператор процессов колбасного производства.

_______________________________________________________________

Пособие предназначено студентам колледжа. Может быть использовано для самостоятельной подготовки к учебным занятиям и внеаудиторной самостоятельной работе.

Составитель: Жукова Л.А. – преподаватель специальных дисциплин

Рецензент: Суханова Н.В.– преподаватель специальных дисциплин

Редактор: Малькова Л.А. – заместитель директора по учебно-методической работе

Рукопись рассмотрена и обсуждена на заседании ЦМК Технологических дисциплин, протокол № __ от __ _______ 2012г.

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Методические указания разработаны в соответствии с действующей программой курса микробиологии, принятой ГАОУ СПО города Москвы Технологическим колледжем №28 для студентов, обучающихся по специальности 260301 «Технология мяса и мясных продуктов».

На современном уровне развития естественных наук требуются глубокие знания микробиологических процессов, лежащих в основе многих биотехнологических производств и служащих гарантией защиты окружающей среды от антропогенного воздействия.

Помимо приобретения теоретических знаний по микробиологии будущим специалистам необходимы лабораторно-практические занятия, являющиеся по сути небольшими научно-исследовательскими работами.

Выполнение лабораторных работ обеспечивает закрепление теоретических знаний студентов, развитие навыков по микробиологическому контролю и способностей к самостоятельным выводам и обобщениям.

Данные методические указания по выполнению лабораторных работ предлагают:

объединить лабораторные работы по одной теме или имеющие одно смысловое содержание так, чтобы удобно было их организовать во времени, как это требует специфика микробиологических анализов;

распределить занятия так, чтобы загруженность последнего занятия давала возможность обсудить результаты анализа, провести зачет по выполненной работе;

сконцентрировать наиболее важный учебный материал, позволяющий студентам без излишней загруженности освоить практические навыки работы в микробиологической лаборатории;

дать методику проведения анализа с указанием сущности метода, техники выполнения, правил обработки результатов;

использовать те методы микробиологического анализа, которые предусмотрены ГОСТом.

Тема и цель работы.

Материальное обеспечение лабораторной работы.

Рекомендации по выполнению лабораторной работы, задание, пояснение к работе, методика проведения анализов, формы для составления отчета, контрольные вопросы к лабораторным вопросам и дополнительная литература.

Ввиду сложности некоторых методов и длительности выращивания микроорганизмов в отдельных случаях часть лабораторного материала готовит заранее преподаватель, но методика приготовления его приводится.

Навыки, приобретенные на лабораторных занятиях, необходимы для проведения микробиологического контроля производства, цель которого заключается в том, чтобы своевременно выявить нарушение санитарного состояния производства и оборудования, обнаружить места и пути микробного загрязнения, принять необходимые меры по ликвидации этих опасных очагов и добиться выпуска продукции высокого качества.

ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Работа в микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения специальных правил, что определяется двумя основными положениями.

Первое – в микробиологической практике используют, главным образом, чистые культуры микроорганизмов, т. е. популяции микроорганизмов одного вида, часто являющихся потомством одной клетки.

Поскольку в воздухе, на поверхности окружающих нас предметов, на одежде, руках, волосах всегда имеется большое количество разнообразной микрофлоры, то для обеспечения стерильности исследований и во избежание загрязнения культур работа должна проводиться с соблюдением правил асептики.

Второе – при исследованиях с неидентифицированными микроорганизмами, при их выявлении из объектов окружающей среды и техногенных потоков, могут быть выделены патогенные и условно патогенные микроорганизмы.

Кроме того, клетки как сапрофитных, так и патогенных микроорганизмов могут являться аллергенами для определенных индивидуумов. Таким образом, для получения достоверных результатов исследований, для обеспечения личной безопасности и безопасности окружающих необходимо соблюдение определенных правил.

При пересевах микроорганизмов стерильность достигается за счет того, что вся работа проводится вблизи пламени горелки. Бактериологические петли, используемые для пересева микроорганизмов с твердых сред, прокаливают в пламени горелки, а стеклянную посуду и питательные среды предварительно стерилизуют в сушильных шкафах и в автоклавах соответственно.

Поверхность рабочего стола дезинфицируют как перед работой, так и после её окончания, протирая 3%-ным раствором хлорамина, лизола или 70%-ным раствором изопропилового или этилового спирта. Растворы данных спиртов могут применяться и для дезинфекции рук.

Подготовка помещения включает мокрую уборку и тщательную вентиляцию с последующим облучением ультрафиолетовым светом бактерицидных ламп. В зависимости от степени загрязненности воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 минут до нескольких часов. Ультрафиолетовые лучи опасны для глаз, поэтому при включенной бактерицидной лампе в помещении находиться нельзя.

При работе в микробиологической лаборатории учащиеся должны соблюдать следующие правила:

1. Каждый студент должен работать на постоянном месте.
2. На рабочем месте не должно быть посторонних предметов (в том числе портфелей и сумок). Во время работы с горелкой на столе не должно быть также и тетрадей, которые понадобятся позже при микроскопии и зарисовке препаратов.
3. Вся работа выполняется в чистом халате. Длинные волосы должны быть подобраны, во избежание их попадания в пламя грелки.
4. На посуде, применяющейся для культивирования микроорганизмов (пробирках, колбах, чашках Петри, матрацах), должны быть сделаны надписи, содержащие родовое и видовое название культуры, дату засева, фамилию студента и номер группы.
5. Все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки, либо погружены в дезинфицирующий раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели).
6. Все засеянные пробирки, чашки или колбы помещаются в термостат или сдаются лаборанту.
7. Отработанный материал помещается в определенные емкости для их дальнейшего обеззараживания.
8. В лаборатории строго запрещается курение и прием пищи.
9. В конце занятий каждый студент должен привести в порядок рабочее место.

Полученные данные должны быть зафиксированы в журнале для лабораторных работ. Записи должны содержать: номер и название работы, дата её начала и окончания, названия объектов исследований, условия проведения опытов, методы анализов, а также полученные результаты и выводы из них. При изучении морфологии культур делаются их зарисовки при определенных увеличениях микроскопа. (На занятиях следует иметь цветные карандаши, как минимум красный и синий.) Цифровые данные обобщаются в таблицах, графиках или диаграммах.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

Организация и оборудование микробиологической лаборатории. Устройство оптического микроскопа и правила работы с ним. Освоение техники микроскопирования микробов.

Цель занятия .

Ознакомить студентов с организацией и оборудованием микробиологической лаборатории. Изучить устройство оптического микроскопа. Ознакомиться с основными формами бактерий.

Материальное обеспечение.

Учебная микробиологическая лаборатория, оснащенная термостатами, стерилизаторами, холодильниками, водяной баней, дистиллятором, бактерицидными лампами, рабочими столами со всеми необходимыми принадлежностями, микроскопами.

Данная лабораторная работа содержит значительный объем учебного материала, поэтому ознакомить студентов с организацией и оборудованием лаборатории желательно демонстрационным методом.

При изучении устройства микроскопа использовать плакат, где показаны все его детали.

Задания.

1. Ознакомиться с пояснением к работе:

1. Оборудование учебной микробиологической лаборатории.
2. Оснащение и организация работы производственной

1. Правила работы в микробиологической лаборатории.
2. Устройство оптического микроскопа и уход за ним.

Правила работы с микроскопом МБР-1.

1. Основные формы бактерий.

1. Провести микроскопию готовых препаратов с основными формами

Бактерий.

Пояснение к работе

1.1 Оборудование учебной микробиологической лаборатории.

Помещение учебной микробиологической лаборатории должно состоять из учебной, технической комнат и комнаты преподавателя.

В учебной комнате должен быть следующий инвентарь: лабораторные столы, столы для микроскопирования, стол для преподавателя, термостаты, табуреты, полка с титрованными растворами, весы, классная доска, стол для посуды, раковина.

Для учебных занятий может быть использован обычный лабораторный стол.

Стол для микроскопирования необходимо устанавливать перед окном; его высота должна быть около 80 см, ширина – около 40 см. Для большей устойчивости стол для микроскопирования устраивают на кронштейнах.

Термостаты. Микробы необходимо выращивать при таких условиях, чтобы температура окружающего воздуха подвергалась, возможно, меньшим колебаниям. Для этого применяют термостаты, представляющие собой шкафы, в которых поддерживается постоянная температура.

Существуют воздушные и водяные термостаты.

Воздушные термостаты обогреваются теплым воздухом, нагреваемым, как правило, электрическим током.

В водяных термостатах между двойными стенками находится вода, нагреваемая электрическим током, газом или другими источниками тепла. Колебания температуры в этих термостатах меньше, чем в воздушных.

В лаборатории должно быть не меньше трех термостатов: температура одного 30˚С, второго 37˚С и третьего 43˚С. Микробов, хорошо развивающихся при 20˚С, можно выращивать при комнатной температуре.

Постоянная температура в термостатах поддерживается специальными приспособлениями – терморегуляторами. В термостате с точным терморегулятором колебания температуры не должны превышать 2˚С.

Автоклав, или стерилизатор. Автоклав представляет собой металлический цилиндр с двойными стенками и массивной крышкой, которая закрывается винтовыми зажимами.

На цилиндр надевается металлический кожух. Автоклав снабжен пароотводной трубкой, манометром, предохранительным клапаном и водомерным стеклом. В нем стерилизуют питательные среды, различные жидкости и посуду.

Перед стерилизацией в автоклав через воронку водомерного стекла наливают дистиллированную или кипяченую воду (при употреблении сырой воды быстро образуется накипь) до черты, указанной на кожухе автоклава. После этого автоклав загружают подлежащим стерилизации материалом (последний необходимо сверху закрывать бумагой), крепко завинчивают крышку, открывают кран пароотводной трубки и начинают подогревать.

Нагрев осуществляется электричеством, паром (в этом случае воду в автоклав не наливают) или несколькими газовыми горелками. По мере нагревания из автоклава начинает выходить сначала воздух, а затем пар, который поступает в автоклав через отверстия в верхней части цилиндра. Когда пар начнет выходить непрерывной струей, его выпускают еще 2-3 минуты для вытеснения воздуха из автоклава, а затем кран закрывают. Вследствие этого прекращается выход пара и постепенно в автоклаве начинает повышаться давление (подъем стрелки манометра).

После установления требуемого давления степень нагревания автоклава уменьшают так, чтобы стрелка манометра оставалась на одном уровне в течение определенного времени. Начало стерилизации считается с момента достижения стрелкой надлежащего давления.

Показания манометра соответствуют определенной температуре пара.

Показания манометра в ати Температура пара в ˚С

0,5 112,0

1,0 121,4

1,5 128,8

2,0 135,1

По окончании стерилизации нагревание прекращают и дают стрелке манометра упасть до нуля. Только после этого открывают кран пароотводной трубки, выпускают пар и впускают воздух, затем отвинчивают крышку, поднимают её и, дав в таком положении остыть автоклаву, вынимают простерилизованный материал.

Посуда и инвентарь.

Чашки Петри служат для посева культур. Употребляют чашки диаметром 10 см (высота 1,5см). Стекло должно быть тонким, прозрачным, без пузырьков воздуха.

Пипетки. При бактериологической работе используют пипетки емкостью 1 -5 и 10 мл. Чаще всего применяются пипетки емкостью 1 мл, длиной около 28 см (без расширения).

Пробирки. Для разливания воды по 10 мл применяются пробирки размером 18 х 2,0 см; используют также пробирки размером 18 х 1,5 см. Для питательных сред используют пробирки размером 15 х 1,8 см.

Иглы и петли. Для взятия исследуемого материала и для посевов пользуются иглами и петлями.

Для мытья лабораторной посуды необходим стол с ванной для мойки .

При работе с микроскопом используют предметные и покровные стекла . Стекла должны быть бесцветными с ровной поверхностью, без пузырьков воздуха. Для специальных исследований применяют предметные стекла с лунками.

1.2 Оснащение и организация работы производственной

Микробиологической (бактериологической) лаборатории.

Бактериологическое исследование продовольственного сырья и продуктов из него проводят в специальной лаборатории, имеющей разрешение на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности. Микробиологическая (бактериологическая) лаборатория (или бакотдел в составе производственной лаборатории мясоперерабатывающего предприятия) предназначена для санитарно-бактериологического контроля сырья, готовой продукции, вспомогательных материалов, санитарно-гигиенического состояния технологического оборудования, инвентаря, тары, одежды и рук персонала.

Помещения лаборатории. Общее размещение лаборатории и её инфраструктура должны соответствовать требованиям ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). В лаборатории предусматриваются следующие отдельные помещения или изолированные рабочие зоны:

для приема, хранения, подготовки и обработки проб;

для проведения первичного посева, пересева, приготовления разведений и других работ в асептических условиях;

для приготовления, стерилизации, розлива и хранения питательных сред, подготовки лабораторной посуды и оборудования;

для обеззараживания и очистки оборудования, отработанных питательных сред и контаминированных микрофлорой материалов.

Термостаты, холодильники, морозильники могут быть расположены в отдельных комнатах.

Помещения необходимо располагать так, чтобы обеспечить защиту их от влияния внешних факторов (повышенная температура, влажность, запыленность, шум, вибрация), организовать поточность прохождения чистых и зараженных материалов.

Мясо может быть обсеменено патогенной микрофлорой, представляющей серьезную опасность для здоровья людей, и помещения лаборатории должны быть изолированы от других отделов. Если нет возможности организовать отдельную комнату, допускается в общем помещении установить стол для проведения первичного посева проб. Целесообразно оборудовать застекленный бокс с предбоксником для обеспечения асептических условий работы.

Лабораторные комнаты должны быть светлыми (освещенность поверхности столов в пределах 500 лк) и просторными – для каждого аналитика рекомендуемая площадь рабочего места около 20 м. Стены, потолок и пол должны быть гладкими, легкоочищаемыми, устойчивыми к действию детергентов и дезинфицирующих веществ. Для удобства очистки и дезинфекции поверхность лабораторного инвентаря и мебели покрывают гладким непроницаемым материалом, например пластиком, а рабочее место - зеркальным столом.

Для бактериологического анализа пищевых продуктов, в частности колбасных изделий и копченостей, необходимы 1-2 бокса с предбоксниками. Боксы представляют собой изолированные, защищенные от пыли остекленные комнаты; максимально допустимое количество частиц размером более 0,5 мкм в 1м не должно превышать 4000.

В помещениях лаборатории регулярно проводят уборку и дезинфекцию, качество которых периодически контролируют микробиологическим методом.

В каждом помещении должны быть холодное и горячее водоснабжение, бутыль с дезинфицирующим раствором для мытья рук.

1.3 Правила работы в микробиологической

лаборатории

Непосредственный контакт с микроорганизмами и необходимость соблюдения стерильных условий при проведении всех операций требуют знания и неукоснительного соблюдения следующих правил:

работать в халатах;

поддерживать чистоту и порядок на рабочем месте;

не касаться пальцами микробных налетов и конденсационной воды в пробирках и чашках с посевами;

не стирать микробных налетов с предметных и покровных стекол и других объектов салфетками, фильтровальной бумагой, дезинфицировать их, помещая в спирт или раствор карболовой кислоты;

в процессе работы и после проведения посевов уничтожать остатки микробных налетов на бактериологических иглах и петлях прокаливанием в пламени спиртовки или газовой горелки;

обезвреживать использованные загрязненные материалы и отработанные культуры микробов стерилизацией в автоклаве (эту работу выполняют сотрудники лаборатории);

не держать спиртовки близко к лицу, зажигать спиртовку только спичкой;

убрать и обработать рабочее место по окончании работы дезинфицирующим раствором под контролем лаборанта; поместить культуры микроорганизмов, необходимые для дальнейшей работы, в холодильник или сейф, который закрывают и пломбируют; поставить в термостат засеянные микрофлорой пробирки и чашки Петри;

мыть тщательно руки по окончании работы, не принимать пищу в лаборатории.

1.4 Устройство оптического микроскопа и уход за ним.

Микроскоп – сложный оптический прибор, увеличивающий предмет в 1000 – 1500 раз. Современный микроскоп состоит из двух основных частей – механической и оптической.

Механическая часть состоит из штатива, в котором различают ножку, основание, тубусодержатель, и предметного столика, прикрепляемого к основанию штатива. Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного и наблюдательного аппаратов.

Осветительный аппарат расположен под предметным столиком и состоит из зеркала, конденсора и ирис-диафрагмы.

Зеркало отражает световые лучи и направляет их к конденсору.

Конденсор представляет собой систему линз и служит для усиления яркости освещения рассматриваемого объекта.

К наблюдательному аппарату относят объективы и окуляры.

Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя или фронтальная линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе – коррекционные.

Биологические микроскопы МБР-1 и МБИ-1 обычно имеют три, четыре объектива с цифровыми обозначениями х8, х20, х40, х90, показывающими собственно увеличение этих объектов.

Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Окуляр представляет собой систему двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклостью в сторону объектива. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, обращенная к препарату – собирающей. Окуляры отечественных микроскопов помечаются цифрами, показывающими их собственное увеличение: х5, х7, х10, х15.

Степень увеличения микроскопа равна произведению степени увеличения окуляра на степень увеличения объектива.

Правила ухода за микроскопом:

Микроскоп предохраняют от попадания пыли, влаги и солнечных лучей. После работы с ним его помещают в футляр или накрывают колпаком из плотной ткани.

Объективы и окуляры протирают замшей или фланелью.

Тубус микроскопа не оставляют открытым, т. е. без окуляра, так как это приводит к накапливанию пыли в тубусе и загрязнению объективов.

Микроскоп состоит из двух основных частей. Основой микроскопа является штатив. К нему прикреплен тубус с заключенной в нем оптической частью и предметный столик. Штатив состоит из основания (или подковообразной ножки) и тубусодержателя. Тубусодержатель соединяется с основанием шарниром, что позволяет верхнюю часть микроскопа устанавливать в наклонное положение для облегчения работы. В тубус помещают объективы и окуляры. Объективы ввинчиваются в нижнюю часть тубуса, называемую револьвером. Окуляры свободно вкладываются в верхнюю часть тубуса. Увеличение можно изменить путем применения различных объективов, которые ввинчивают во вращающийся барабан револьвера.

Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта. Чтобы препарат был ясно виден, тубус при помощи механизмов грубого или микрометрического движения необходимо передвигать в направлении его оптической оси. Грубое движение должно осуществляться достаточно легко, но без самопроизвольного опускания тубуса. Для более точной установки служит микрометрический винт. Микрометрический винт имеет сложную конструкцию, является одной из наиболее легко повреждающихся частей микроскопа. Нельзя поворачивать винт более чем на пол-оборота в ту или иную сторону (после грубой установки микроскопа). Предметный столик служит для помещения исследуемого препарата.

Оптическая часть состоит из зеркала, конденсора с диафрагмой, объективов и окуляров. Зеркало микроскопа подвижное. При искусственном свете лучше пользоваться вогнутым зеркалом, при рассеянном свете – плоским. Зеркало отражает световые лучи и направляет их к конденсору. Конденсор применяется для получения более сильного освещения препарата. Диафрагма служит для регулирования освещенности препарата. Диафрагма находится между нижней поверхностью конденсора и зеркалом.

Объективы – наиболее важная часть микроскопа, определяющая его оптическую мощность. Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя или фронтальная линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе коррекционные. Окуляры увеличивают изображение, даваемое объективом, но не выявляют каких-либо деталей исследуемого препарата.

Объективы, которые при работе нужно погружать в кедровое масло, называют иммерсионными, или погружными. Сухой объектив – это объектив, у которого между препаратом и линзой находится воздух. Каждый микроскоп снабжен сухими и иммерсионными объективами. Объективы с собственным увеличением 8 и 40 являются сухими, объектив с собственным увеличением 90 – иммерсионный.

Правила работы с микроскопом МБР-1

1. Микроскоп хранят в шкафу для защиты от пыли, влаги и света. Переносят микроскоп правой рукой, держась за ручку штатива, левой поддерживают снизу.
2. Приступая к работе с микроскопом окуляр, объектив и зеркало протрите салфеткой.
3. Установите микроскоп штативом к себе, предметным столиком от себя. По отношению к сидящему микроскоп должен быть сдвинут ближе к левому плечу. Справа от микроскопа располагают альбом, простой и цветные карандаши, ластик.
4. Поставьте в рабочее положение объектив малого увеличения. Для этого поворачивайте револьвер до тех пор, пока нужный объектив не займет срединное положение (встанет над отверстием столика). Когда объектив занимает срединное положение, в револьвере срабатывает специальное устройство – защелка, при этом слышится легкий щелчок и револьвер фиксируется. Запомните, что изучение любого объекта начинается с малого увеличения.
5. Поднимите с помощью макрометрического винта объектив над столиком примерно на 1 см. Откройте диафрагму, поднимите конденсор до уровня предметного столика.
6. Глядя левым глазом в окуляр, при помощи зеркала наведите свет так, чтобы все поле зрения было освещено ярко и равномерно.
7. Положите на предметный столик, приготовленный препарат покровным стеклом вверх, чтобы объект находился в центре отверстия предметного столика. Опустите с помощью макрометрического винта объектив над препаратом на 0,2 см.
8. Смотрите в окуляр, одновременно медленно поворачивайте кремальеру на себя и плавно поднимайте тубус до тех пор (0,5 см), пока в поле зрения не появится изображение объекта; осторожно вращая микрометрический винт не более чем на ½ или ¾ полного оборота, добейтесь четкой видимости.
9. Переходя к рассмотрению объекта при большом увеличении, необходимо центрировать препарат, т.е. поместить интересующую часть объекта в самый центр поле зрения. Для этого передвигайте препарат с помощью препаратоводителей или руками, пока объект не займет нужного положения. Если объект не будет центрирован, то при большом увеличении он останется вне поля зрения.
10. Переходя с меньшего на большее увеличение, поворотом револьвера поставьте объектив большего увеличения против нижнего отверстия тубуса. Смотрите в окуляр и, осторожно вращая микрометрический винт, добейтесь четкого изображения.
11. При зарисовке препарата смотрите в окуляр левым глазом, а правым в альбом.
12. После работы с использованием микроскопа при помощи револьвера замените объектив большого увеличения на объектив малого, снимите со столика препарат и поставьте его на место.
13. Уберите за собой рабочий стол; препараты и методические указания на стол преподавателя.

1.5 Основные формы бактерий.

По форме бактерии принято делить на шаровидные (кокки), палочковидные (клостридии, бациллы) и извитые (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Кокковидные формы по расположению кокков подразделяются на микрококки – клетки, расположенные одиночно; диплококки – кокки, соединенные по два; тетракокки – кокки, соединенные по четыре; стрептококки – кокки, расположенные в виде длинной или короткой цепочки; сарцины – кокки, расположенные в виде пакетов; стафилококки – беспорядочное скопление кокков, чаще в виде гроздьев винограда.

Палочковидные формы по расположению палочек подразделяют на диплобактерии – палочки, соединенные попарно; стрептобактерии – палочки, расположенные в виде цепочки. Среди спорообразующих различают бациллы и клостридии. У бацилл диаметр спор не превышает ширины вегетативной клетки, а у клостридий – спора больше ширины клетки, поэтому клетка принимает форму веретена, теннисной ракетки, барабанной палочки.

Извитые формы подразделяют на вибрионы, имеющие формы запятой, спириллы, имеющие несколько (до 5) завитков, и спирохеты с большим количеством мелких завитков.

Порядок выполнения

2. Микроскопия готовых препаратов с основными формами бактерий .

Техника микроскопирования.

На предметный столик помещают исследуемый препарат и закрепляют клеммами.

При работе с иммерсионным объективом 90 на препарат наносят каплю иммерсионного масла, а затем с помощью макрометрического винта осторожно опускают тубус с центрированным объективом 90 так, чтобы его фронтальная линза погрузилась в каплю масла, а фокус был ниже препарата. Затем, глядя в окуляр, тем же винтом очень медленно поднимают тубус (на сотые доли миллиметра), пока не увидят изображение микробов. Точную установку препарата в фокус объектива производят с помощью микрометрического винта.

Примечание.

Достоинством иммерсионной системы является то, что при погружении объектива в масло, лучи света, проходящие через среды стекло-масло, почти не преломляются, так как показатель преломления света для этих сред почти одинаков. В результате этого освещенность при микроскопировании с маслом максимальна.

По окончании работы удаляют салфеткой из мягкой ткани иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива 90, для более полного удаления масла фронтальную линзу протирают салфеткой, смоченной смесью спирта и эфира в пропорции 1:1, затем протирают объектив досуха. Микроскоп помещают на хранение.

При микроскопировании обратить внимание на форму и размер клеток изучаемого микроорганизма, на особенности строения клеток – наличие спор и капсул у бактерий, почек – у дрожжей; в препарате плесеней – на разнообразие форм клеток: круглые, овальные, вытянутые, цилиндрические, ветвистые.

Отчет по результатам микроскопирования .

Результаты микроскопирования заносятся в таблицу (форма1).

Форма 1

Контрольные вопросы.

1. Каким оборудованием должна быть оснащена микробиологическая лаборатория, его назначение?
2. Основные правила работы в микробиологической лаборатории.
3. Каково устройство оптической системы биологического микроскопа?
4. Какие правила необходимо соблюдать при пользовании и уходе за микроскопом?
5. Какие основные формы бактерий вы знаете?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2.

Приготовление микробиологических препаратов для изучения живых микроорганизмов («раздавленная капля» и «висячая капля»). Приготовление мазков из микробных культур.

Любая работа по приготовлению препаратов микроорганизмов, так же как и по пересевам микроорганизмов, проводится с соблюдением правил асептики.

Оборудование лабораторного стола.

Для работы с микроорганизмами требуется определенное оборудование. На рабочем лабораторном столе должны быть спиртовка или газовая горелка, бактериологическая петля, предметные и покровные стекла, набор красок, микроскоп, салфетка, кедровое масло, пинцет, кювета с мостиком, сосуд с водой, песочные часы, карандаш по стеклу, фильтровальная бумага.

Цель занятия .

Ознакомиться с методами исследования бактерий на подвижность.

Материальное обеспечение.

Молодые бульонные культуры микроорганизмов в пробирках для исследования на подвижность, предметные и покровные стекла, предметные стекла с луночкой, бактериологические петли, пастеровские пипетки, микроскопы, спички, спиртовые или газовые горелки.

Преподаватель должен продемонстрировать технику приготовления неокрашенных препаратов микроорганизмов, подготовку микроскопа к работе, регулирование освещенности поля зрения, установку увеличителя, технику микроскопирования препаратов.

Во время работы студентов преподавателю следует постоянно проверять освещенность поля зрения в каждом микроскопе, в необходимых случаях помочь отрегулировать ее и посмотреть изображения найденных объектов. Просмотру неокрашенного препарата следует уделить особое внимание, так как студенты должны видеть здесь и форму клеток, и их подвижность.

Задания.

1. Приготовить препараты «раздавленная и висячая капля» для определения подвижности бактерий.
2. Приготовить мазок из микробной культуры.
3. Изучить технику микроскопирования и посмотреть приготовленные препараты под микроскопом.
4. Составить отчет по результатам микроскопирования.
5. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Порядок выполнения

1. Исследование подвижности микробов в препаратах «раздавленная и висячая капля».

Раздавленная капля.

Если организмы находятся в жидкой среде, капля суспензии наносится на обезжиренное предметное стекло с помощью стерильной пипетки. (Пипетка после употребления сразу же помещается в фарфоровый стакан с дезинфицирующим раствором. Класть грязную пипетку на рабочий стол недопустимо!). Если же культура выращена на твердой питательной среде, то на стекло предварительно наносят каплю воды, а затем помещают в неё клетки микроорганизмов или исследуемую пробу тестируемого продукта бактериологической петлей, прокаленной в пламени горелки, и тщательно размешивают.

Каплю жидкости накрывают покровным стеклом. Чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха, покровное стекло сначала ставят на предметное стекло одним ребром, а затем плавно опускают, прижимая «раздавливая» при этом каплю. Желательно избегать избытка жидкости, чтобы суспензия микроорганизмов не выдавливалась из-под покровного стекла. Если это произошло, лишнюю жидкость удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Использованную бумагу следует сразу же поместить в дезинфицирующий раствор.

Для микроскопирования препарата «раздавленная капля» используют только объективы с сухой системой, то есть без иммерсии. Этот вид препарата позволяет установить форму клеток, их размер, способ спорообразования, а если клетки живые, то и наличие или отсутствие подвижности.

Достоинство препарата – получается тонкий слой жидкости, где можно увидеть живые организмы.

Недостаток – быстро высыхает, и движение прекращается, часто попадает воздух, что нарушает микроскопическую картину.

Для приготовления препарата « висячая капля » на покровное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Если предстоят многодневные наблюдения, то края лунки смазывают вазелином и капля оказывается герметически заключенной во влажной камере. Препарат «висячая капля» используют для выявления подвижности у микроорганизмов, изучения способов размножения, наблюдения за прорастанием спор.

Для приготовления препарата-мазка исследуемую культуру микроба осторожно распределяют равномерным тонким слоем на предметном стекле. При приготовлении культур выросших на плотных средах, поступают следующим образом. На чистое предметное стекло стерильной пипеткой или бактериологической петлей наносят каплю стерильной водопроводной воды или физиологического раствора.

а) Берется пробирка с культурой, из которой необходимо приготовить мазок. Бактериологическую петлю прокаливаем в пламени горелки, держа её в вертикальном положении.

б) Зажав пробку между мизинцем и ладонью правой руки, вынимаем её из пробирки и держим концом вниз, не допуская соприкосновения с рукой той части пробки, которая находилась в пробирке.

в) Открытый конец пробирки обжигаем на пламени.

г) Вводим в пробирку петлю (ещё раз проведенную через пламя), охлаждаем прикосновением к стенке пробирки и набираем небольшое количество материала, слегка прикасаясь к культуре и не царапая среду петлей.

д) Края пробирки и конец ватной пробки обжигаем над пламенем горелки.

е) Пробирку закрываем ватной пробкой.

ж) Взятый материал эмульгируют в имеющийся на предметном стекле капле и равномерно тонким слоем петлей распределяют по поверхности (1,5 х 2 см).

з) Петлю прокаливают и кладут на место.

Если культура выращена в жидкой питательной среде, то стерильную петлю опускают в жидкость, захватывают каплю и растирают на предметном стекле.

3.Техника микроскопирования .

Помещают микроскоп на рабочем столе от края на 3-5 см тубусодержателем к себе.

Устанавливают хорошее равномерное освещение поля зрения микроскопа, для чего, глядя в окуляр, зеркалом направляют луч света от источника в объектив. Конденсор должен быть поднят вверх, а диафрагма открыта. Поле зрения микроскопа должно быть хорошо и равномерно освещено во всех точках.

На предметный столик помещают исследуемый препарат мазком или каплей вверх и закрепляют клеммами.

Неокрашенные препараты микроскопируют с объективами х8 и х40, опуская конденсор на 1- 0,5 см до препарата, добиваются наилучшей видимости неокрашенных клеток.

При микроскопировании «живых» микробов (неокрашенный препарат) отметить подвижность.

4.Отчет по результатам микроскопирования.

в) рисунок клеток под микроскопом (указать наличие спор, капсул, почек, подвижность).

5.Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какова техника приготовления препаратов «раздавленная и висячая капля»?
2. Какова методика приготовления мазка из культуры бактерий, выращенных на плотной питательной среде?
3. Что позволяет установить препарат «раздавленная капля»?
4. Для каких исследований используют препарат «висячая капля»?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3.

Приготовление окрашенных препаратов бактерий.

Цель занятия.

Научиться готовить и окрашивать бактериальные препараты простым методом и по методу Грама.

Материальное обеспечение.

Набор готовых растворов красок во флаконах, набор сухих красок во флаконах или в пробирках с резиновыми или корковыми пробками: основной и кислый фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, сафранин, малахитовая и бриллиантовая зелень, смесь микробов: культуры грамположительных бактерий (Bac. subtilis, Staph. saprophyticus), грамотрицательных микробов (E. coli), выращенных на скошенном МПА, предметные стекла, раствор водного фуксина (фуксин Пфейффера), бактериологические петли, фильтровальная бумага, микроскопы, спиртовые или газовые горелки.

Преподаватель должен продемонстрировать технику приготовления окрашенных препаратов микроорганизмов, подготовку микроскопа к работе, регулирование освещенности поля зрения, установку увеличителя, технику микроскопирования препаратов.

Во время работы студентов преподавателю следует постоянно проверять освещенность поля зрения в каждом микроскопе, в необходимых случаях помочь отрегулировать её и посмотреть изображения найденных объектов. При просмотре окрашенного препарата студент должен видеть наличие спор и капсул у микроорганизмов.

Задания.

1. Приготовить мазок из зубного налета и окрасить простым методом.
2. На одном предметном стекле приготовить мазок из смеси стафилококка и кишечной палочки и окрасить по Граму.
3. Просмотреть с иммерсионным объективом окрашенные мазки.
4. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Ответить на контрольные вопросы.

Пояснение к работе

Для изучения формы микробной клетки и некоторых её структур препарат (мазок) из материала, содержащего исследуемый микроб, окрашивают.

Большинство микробов быстро и хорошо окрашиваются растворами анилиновых красителей. По химическим свойствам их принято делить на основные и кислые. У основных красителей хромофором (ион, придающий окраску) является катион, у кислых – анион.

К основным красителям относятся красные – нейтральный красный, фуксин основной, сафранин, тионин, пиронин, гематоксилин; синие – метиленовый синий; фиолетовые – кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый; зеленые – малахитовый зеленый, метиленовый зеленый. Основные красители, как правило, легко связываются с ядерными (кислыми) компонентами клеток.

К кислым красителям относятся красные и розовые – фуксин кислый, эозин; желтые – пикриновая кислота, конго, флуоресцен; черные – нигрозин. Кислые красители более интенсивно окрашивают (основные) компоненты клеток.

Приготовление рабочих растворов красок. Прежде чем приготовить рабочие растворы красок, предназначенные для окрашивания микробов, часто заблаговременно из сухих красок, предназначенные для окрашивания микробов, часто заблаговременно из сухих красок готовят насыщенные спиртовые растворы. Для этого краску заливают 96%-ным спиртом в соотношении 1:10. При таком соотношении спирт насыщается краской (нерастворенная часть красок выпадет в осадок). С целью экономии рекомендуется брать на 100 см³ спирта метиленового синего 7,0, генцианвиолета 4,8, основного фуксина 8,1.

Для лучшего насыщения спиртовые растворы помещают в термостат и выдерживают до полного растворения красок. Из насыщенных спиртовых растворов по мере надобности готовят водные рабочие растворы.

Наиболее часто употребляют следующие растворы красителей:

Карболовый раствор фуксина Циля. К 100 мл 5%-го раствора кристаллической карболовой кислоты добавляют 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина основного. Насыщенный раствор фуксина получают при смешивании 8 г кристаллов фуксина в 10 мл спирта. Краска имеет красный цвет.

Фуксин Пфейффера представляет собой карболовый раствор фуксина Циля, разведенный в дистиллированной воде 1:10. Готовится непосредственно перед использованием. Краска имеет насыщенный розовый цвет.

Карболовый раствор генцианвиолета. К 10 мл насыщенного спиртового раствора краски добавляют 100 мл 2%-го водного раствора карболовой кислоты. Насыщенный раствор получают, растворяя 1г кристаллического генцианвиолета в 10 мл 96%-ного спирта. Краска имеет сине-фиолетовый цвет.

Сафранин. Готовят непосредственно перед использованием, добавляя к 100 мл горячей воды 1г сафранина. Краска имеет красно-коричневый цвет.

Метиленовая синяя (синька Леффлера). Готовят, добавляя к 100 мл дистиллированной воды 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1%-го водного раствора КОН или NaOH. Раствор имееи темно-синий цвет.

Малахитовая зелень. 1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют. Раствор имеет сине-зеленый цвет.

Раствор Люголя. Берут 1г кристаллического йода и 2г йодистого калия на 300 мл дистиллированной воды. Сначала в небольшом количестве воды растворяют йодистый калий, а затем прибавляют кристаллы йода. После полного растворения добавляют остальную дистиллированную воду.

Сложные способы окраски применяют для детального изучения структуры клетки, а также для дифференциации одних микроорганизмов от других. Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения клетки и её частей. Наибольшее практическое знание имеет окраска по Граму, позволяющая дифференцировать бактерии по химическому составу и структуре клеточной стенки.

Метод был разработан датским ученым Христианом Грамом в 1885 г. При окраске по методу Грама все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

Порядок выполнения

Методика окраски по Граму.

1.Метод простой окраски. При простом методе окраски используется один какой-нибудь красящий раствор, чаще всего фуксин Пфейффера или метиленовый синий.

На фиксированный препарат помещают пипеткой несколько капель красящего раствора так, чтобы покрыть всю поверхность мазка: фуксин Пфейффера на 1-2 мин, метиленовый синий на 3-5 мин. Затем краску смывают водой, а мазок просушивают между листочками фильтровальной бумаги или на воздухе.

2.Сложные методы окраски применяют с целью диагностики, выявления отличительных структур микробов в случаях, когда последние не окрашиваются простым способом.

Для дифференциации микробных клеток, различающихся химическим составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод окраски – окраска по Грамму.

По окраске по Грамму все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

У грамположительных бактерий (Г+) толщина клеточной стенки составляет 15-80 нм, состоит из пептидогликана (от 60-90%), расположенного в несколько слоев, белка (около 1%) и липидов (около 1%). Обнаружены полимеры особого типа – тейхоевые кислоты, ковалентно связанные с пептидогликаном. Большое содержание пептидогликана обеспечивает при окраске по Граму образование комплекса с генциановым фиолетовым и йодом, устойчивого к спирту, вследствие чего они окрашены в сине-фиолетовый цвет.

Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий (Г-) 10-15 нм, но структура её значительно сложнее, чем у грамположительных бактерий. Основу её составляют ориентированные внутренние липиды (10-20%), которые с поверхностно расположенными полисахаридами образуют липополисахаридный слой. На поверхности клеточной стенки мозаично расположены белки и полисахариды. Пептидогликан представлен одним слоем толщиной всего 2-3 нм (около 5-10%), лежит под липополисахаридным слоем и плотно прикрывает протопласт. Из-за большего содержания липидов клеточная стенка грамотрицательных бактерий при окраске по Грамму образует с генциановым фиолетовым и йодом комплекс, разрушаемый при обработке спиртом, вследствии чего клетки обесцвечиваются.

Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму связано с различиями в структуре и химическом составе клеточной стенки бактерий.

К грамположительным микроорганизмам относятся кокки, бациллы (спорообразующие палочки), актиномицеты, микобактерии, клостридиальные бактерии.

К грамотрицательным микроорганизмам относятся: бактерии (неспорообразующие палочки), спириллы, сальмонеллы, E coli, псевдомонады, азотбактер, вибрионы.

Имеются грамвариабельные микроорганизмы, отношение которых к окраске по Граму меняется на определенных этапах их жизненного цикла. Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста, для окраски по Граму используют клетки молодой культуры, чаще односуточной. Для сравнения одновременно с определяемым объектом целесообразно окрашивать клетки микроорганизмов, отношение которых к окраске по Грамму известно (контроль).

Окраску по Грамму осуществляют следующим образом:

1. Готовят на предметном стекле три мазка культуры микроорганизмов: в центре – мазок исследуемой культуры, слева и справа – мазки контрольных микроорганизмов.

Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки равномерно были распределены по поверхности стекла и не образовывали скоплений, так как от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания. Высушивают мазки на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

1. Окрашивают мазки карболовым генциановым фиолетовым. На мазки наносят достаточное количество красителя, выдерживают 1-2 мин, краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором Люголя до почернения (приблизительно 1-2 мин).
2. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0,5-1 мин (строго) 96%-ным этиловым спиртом путем погружения в стаканчик со спиртом или путем нанесения спирта на мазки (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработке все бактерии сохраняют окрашивание, при чрезмерной – обесцвечиваются).
3. Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1-2 мин водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
4. Микроскопируют препарат с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваютя в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный или розовый цвет фуксина (цвет дополнительного красителя).

Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов (по Крегенсену).

Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде и определении свободной ДНК.

На предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора КОН, в которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии (24-часовая культура со скошенного агара) и хорошо перемешивают петлей.

Через 5-10 с при передвижении петли по стеклу при положительной реакции в результате тестирования грамотрицательных бактерий образуется слизистый след длиной 1-2 см. Если слизь не образуется, то реакция отрицательная, тогда тестируется грамположительная культура.

3. Отчет по результатам микроскопирования.

а) система микроскопирования;

б) микроскопируемая культура;

в) рисунок клеток под микроскопом (указать наличие спор, капсул).

4. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какие растворы красителей используют при простом методе окраски?
2. Опишите методику окраски бактерий по Граму.
3. Почему бактерии по разному воспринимают окраску по методу Грама?
4. Какие бактерии относятся к грамположительным, а какие к грамотрицательным ?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4

Питательные среды и техника их приготовления.

Цель занятия.

Овладеть техникой приготовления питательных сред.

Материальное обеспечение.

Сухие питательные среды, среды, готовые к употреблению, электроплитка, посуда для варки сред, индикаторная бумага, 20%-ный едкий натр, 20%-ная соляная кислота, пробирки, пипетки, чашки Петри.

Перед выполнением работы студенты повторяют вопросы питания микроорганизмов, питательные среды, классификацию питательных сред, основные требования к питательным средам.

При выполнении лабораторной работы студенты готовят питательную среду.

Задания.

1. Ознакомиться с пояснением к работе.
2. Приготовить питательную среду (по заданию преподавателя).
3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Ответить на контрольные вопросы.

Пояснение к работе

В бактериологических лабораториях нельзя обойтись без питательных сред. Для определения вида микроорганизма, обнаружения возбудителя инфекционной болезни, т. е. установления диагноза заболевания, производства специфических препаратов (вакцин, сывороток), для лечения и профилактики инфекционных болезней, получения антибиотиков, санитарно-микробиологических исследований объектов внешней среды, бактериологического исследования мяса и мясных продуктов прибегают к искусственному выращиванию микроорганизмов на питательных средах.

В лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных пробирках, колбах или других сосудах. Для культивирования in vitro необходимы субстраты, которые микроорганизмы используют в качестве питательных веществ.

По потребности в питательных веществах все микроорганизмы можно разделить на три группы:

первая группа - неприхотливые, растущие на простых средах (гнилостные, большинство кокковых и других микроорганизмов);

вторая группа - требующие для своего роста дополнительных питательных веществ: полноценного белка (куриного или сывороточного), витаминов, определенного набора аминокислот, микроэлементов (туберкулезная, туляремийная палочки, лептоспиры и др.);

третья группа – не растущие на искусственных питательных средах, а способные размножаться только внутри живых клеток (вирусы, риккетсии).

К питательным средам предъявляют следующие требования:

1. Они должны содержать источники азота и углерода, неорганические соединения, микроэлементы, а также факторы роста, витамины, в основном группы В.

В качестве универсального источника азота используют пептоны. Пептоны – это продукты гидролизного расщепления мяса или казеина. В них содержатся полипептиды, аминокислоты и основные минеральные вещества.

В качестве универсального источника углерода в питательные среды добавляют углеводы (сахара) – глюкозу, лактозу, сахарозу, органические кислоты – молочную, лимонную и др., многоатомные спирты – маннит, глицерин, сорбит и др.

2. Питательные среды должны иметь определенную реакцию среды. Так, для большинства кокковых, гнилостных и патогенных микроорганизмов оптимум рН 7,0…7,4, а плесневые грибы, дрожжи, молочнокислые микроорганизмы лучше развиваются при рН 6,0.

3. Питательная среда должна быть стерильной, т.е. не содержать микроорганизмов.

4. Питательная среда должна быть влажной, так как питание у микроорганизмов осуществляется по законам диффузии и осмоса. Многие среды должны быть прозрачными для того, чтобы можно было различить на них рост микроорганизмов и наблюдать за физиологическими изменениями, происходящими в результате их жизнедеятельности.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие и плотные. Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар 2…3%-ной концентрации, для полужидкой – агар-агар 0,2…0,3%-ной концентрации.

По происхождению различают среды естественные и искусственные.

Естественные питательные среды представляют собой продукты животного происхождения (кровь, сыворотка крови, молоко, желчь …) или растительного происхождения (овощи, фрукты, злаковые), которые используют для культивирования микроорганизмов без специальной обработки с полным сохранением их естественных свойств.

Искусственные питательные среды готовят из продуктов переработки растений, мяса, молока, печени и др., часто с добавлением к ним углеводов, поваренной соли, красок и т.п.

Среди искусственных сред выделяют синтетические среды, т.е. среды с точно известным химическим составом. Искусственные питательные среды подразделяются на простые, или обычные, и сложные.

Простые питательные среды служат для культивирования большинства микроорганизмов. Белковой основой всех сред является питательный бульон. Обычно пользуются двумя способами приготовления основного питательного бульона: на мясной воде с добавлением готового пептона – мясопептонный бульон, на переварах продуктов гидролиза исходного сырья с помощью ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислот, такие среды богаче аминокислотами.

От азотистого состава мясопептонных сред и от степени расщепления белка в мясных и других гидролизатах зависит содержание в среде общего и аминного азота.

Для хорошего роста большинства микроорганизмов необходимо содержание в 100 см бульона не менее 250 … 300 мг общего азота при наличии в этом количестве аминного азота (аминокислот) в среднем около 25…30%.

Наиболее распространенными простыми питательными средами являются мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный желатин (МПЖ).

Мясопептонный агар (МПА) – используют для определения общего количества микроорганизмов.

Основой для всех трех сред является мясная вода, которую готовят из фарша говядины, залитого водой и сваренного в течение 1,5 … 2 часов, профильтрованного и простерилизованного в течение 20 …30 минут при 120˚С.

Мясо-пептонный бульон. К 1л мясной воды добавляют 1% пептона и 0,5% поваренной соли, подщелачивают 10%-ным раствором NaOH до рН 7,4, фильтруют и стерилизуют в течение 15 …20 мин при давлении 0,1 МПа.

Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону добавляют мелко измельченный агар-агар (2…3%), нагревают смесь до расплавления агара, устанавливают рН до 7,2…7,6, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и колбам стерилизуют в течение 20…30 мин при 120˚С.

При необходимости МПА разогревают на водяной бане до полного расплавления. Пробирки укладывают в специальные штативы под углом 10˚ и после застывания получают так называемый скошенный агар, который используют для посевов микроорганизмов. Расплавленный мясо-пептонный агар разливают также в чашки Петри.

Аналогично готовят мясо-пептонный желатин.

Порядок выполнения

2. Приготовление питательной среды из готовой сухой питательной среды.

Сухие питательные среды. Выпускаются простые, элективные и дифференциально-диагностические сухие питательные среды. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, легко растворяющиеся в воде. Сухие питательные среды выпускаются в стеклянных банках с плотно завинчивающимися крышками.

Такие среды готовят согласно инструкции, растворяя порошок в указанном количестве дистиллированной воды, фильтруют и стерилизуют при температуре 120˚С в течение 20 мин.

Сухой питательный агар готовят следующим образом: к растворенному сухому агару (5 г агара на 100 мл) добавляют в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого экстракта, мясной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин.

3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные требования к питательным средам?
2. Какие наиболее употребляемые питательные среды, предназначенные для культивирования микроорганизмов, их назначение?
3. Какие компоненты входят в состав простых питательных сред?

Список используемой литературы

1. Градова Н. Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии – М.: ДеЛи принт, 2010.
2. Мармузова Л. В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности – М.: 2005.
3. Мудрецова-Висс К. А. Микробиология, санитария и гигиена – М.: ДЛ, 2010.

«Основы микробиологии, санитарии и гигиены».

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

для учащихся профессии НПО

34.17 Оператор процессов колбасного производства.

__________________________________________________________________

Жукова Любовь Анатольевна, преподаватель специальных дисциплин ГАОУ СПО города Москвы ТК № 28

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

Технологический колледж № 28

Адрес: Москва, ул. Верхние поля, 27

Сдано в печать 07.02.2012.

Формат бумаги 60х90/16

Тираж 16 экз.

Отпечатано в типографии:

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

«Иркутский государственный университет»

МАЛЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Иркутск 2009

УДК 579(076.5)

Печатается по решению редакционно-издательского совета Иркутского государственного университета

Жилкина практикум по микробиологии: Учеб.-метод. пособие для студ. высш. учеб. заведений по специальностям «Микробиология», «Биология» и «Физиология».

6. Микробная масса не должна загрязнять руки, стол и окружающие предметы. Пролившуюся микробную взвесь обезвреживают, используя дезинфицирующие средства.

7. После окончания работы культуры сдают преподавателю, засеянные пробирки и чашки ставят в термостат.

8. Бактериологические петли, иглы, пинцеты и другие металлические предметы после соприкосновения с микроорганизмами прожигают в пламени спиртовки и ставят в специальный штатив.

9. Использованные предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели и т. д. помещают в 3–5%-ный раствор карболовой кислоты или другие дезинфицирующие растворы.

10. Отработанные культуры в пробирках, чашках Петри и т. д. обезвреживают при помощи дезинфицирующих растворов в течение суток, затем посуду кипятят и моют.

11. Следует строго соблюдать личную гигиену – после окончания работы необходимо тщательно вымыть руки с мылом.

12. Необходимо соблюдать технику безопасности при работе с электроприборами и химическими реактивами.

УЧЕБНИКИ И УЧЕБНЫЕ ПОСОБИЯ ДЛЯ СТУДЕНТОВ

ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ

В. Н. КИСЛЕНКО

ПРАКТИКУМ

ПО ВЕТЕРИНАРНОЙ

МИКРОБИОЛОГИИ

И ИММУНОЛОГИИ

Допущено Министерством сельского хозяйства РФ в

качестве учебного пособия для студентов высших

учебных заведений, обучающихся по специальности

«Ветеринария»

МОСКВА «КолосС» 2005

УДК 619: 579(075.8) ББК 48я73 К44

Редактор Т.С. Мояочаева
Рецензенты: доктор ветеринарных наук, профессор В. И. Плешакова (Ин­ститут веете

ринарной медицины Омского ГАУ); доктор ветеринарных наук, про­фессор IT . И. Ба

рышников (Институт ветеринарной медицины Алтайского ГАУ)

Кисленко В. Н.

К44 Практикум по ветеринарной микробиологии и иммуно­логии. - М.: КолосС, 2005.- 232 с. л.: ил. - (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений). ISBN 5-9532-0332-2

Практикум состоит из двух разделов. Раздел «Общая микробиология» содержит сведения о правилах работы в бактериологической лаборатории, описание основных микробиологических, генетических и иммунологичес­ких методов изучения микроорганизмов. В разделе «Возбудители инфек­ционных болезней» перечислены методы лабораторной диагностики, диф­ференциации возбудителей и дан перечень применяемых биопрепаратов.

Приведены методические указания к проведению практических заня­тий для преподавателей.

Прилагаются комплекты тестов на электронном носителе (CD-диске) по общей и частной микробиологии, иммунологии, а также по теоритичес­кому курсу.

Для студентов высших учебных заведений по специальности «Ветери­нария».

ВВЕДЕНИЕ

Ветеринарные лаборатории - это учреждения государственной ветеринарной службы, деятельность которых направлена на обес­печение благополучия в животноводстве, предупреждение и лик­видацию болезней и гибели животных, а также на охрану населе­ния от болезней, общих для животных и человека. По назначению ветеринарные лаборатории бывают районные, межрайонные (зо­нальные), областные (краевые) и республиканские.

Основная задача ветеринарных лабораторий - установление точного диагноза болезней сельскохозяйственных животных, включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел, а также проведение экспертизы мяса, молока и других пищевых продуктов животного и растительного происхождения. В лабораториях также выполня­ют научные работы, осуществляют производство некоторых био­стимуляторов, антибиотиков и др.

Материалом для лабораторных исследований служат кровь, моча, мокрота, молоко, фекалии, содержимое абсцессов (гной), полученные при жизни животного; кусочки паренхиматозных ор­ганов или других тканей после их гибели, пробы объектов окружа­ющей среды (вода, воздух, почва, корма, растения, смывы с пред­метов ухода). Материал в лаборатории исследуют бактериологи­ческими, серологическими, гистологическими, биохимическими, микологическими и токсикологическими методами, для чего дол­жны быть созданы необходимые условия (специально отведенные помещения, оборудование, микроклимат и др.).

Лаборатория занимает отдельное здание, расположение вдали от проезжих дорог. В ней должны быть приемное отделение, пато-логоанатомический, бактериологический, серологический, биохи­мический и вирусологический отделы, а также специальные по­мещения для термостатов, мытья посуды, автоклавная. В комнате для мытья посуды находятся столы, раковины, горячее и холодное водоснабжение, газовая или электрическая плита, стеллажи для вымытой посуды, вытяжной шкаф, эмалированные ванны, тазы и другие емкости, раствор кислоты в стеклянных сосудах для обезза­раживания пипеток, предметных стекол и другой посуды. Отдель­ное помещение отводят под бактериологическую кухню (средова-рочная), где готовят питательные среды для культивирования микроорганизмов, подготавливают посуду для стерилизации. Здесь же в шкафах хранят стерильную посуду и хорошо упакован­ные химические вещества, компоненты питательных сред.

Для выполнения работы в асептических условиях оборудуют специальные изолированные помещения - боксы (англ. box - ко­робка), состоящие из собственно бокса и предбоксника. Исполь­зуют также настольные боксы, предметы и воздух в которых обез­зараживают лампами УФИ, и ламинарные шкафы, где кроме это­го применяют активное удаление воздуха.

Лабораторных животных (белых мышей, морских свинок, бе­лых крыс, кроликов и др.) размещают в виварии. Как правило, в виварии содержат также здоровых баранов-доноров, кровь кото­рых используют для реакции связывания комплемента (РСК) и приготовления питательных сред. Зараженных лабораторных жи­вотных содержат в изолированном помещении.

Кроме того, в здании есть комнаты для специалистов, обслужи­вающего персонала, кабинет заведующего, библиотека, весовая, раздевалка, склад и др.

Чтобы поддерживать надлежащую чистоту, пол в комнатах по­крывают линолеумом или кафельной плиткой. Стены и потолки, как правило, гладкие (без карнизов и лепных украшений), с зак­ругленными углами, окрашенные в светлые тона масляной крас­кой. Потолки можно белить известью. Желательно стены облице­вать пластиком или плиткой от пола до потолка.

В лаборатории должны быть горячая и холодная вода, канализация, педальные ведра для мусора, которые ежедневно освобождают, моют и дезинфицируют, полотенца, мыло и дезинфицирующий раствор. В комнатах находится только самое необходимое оборудование: столы, шкаф для хранения мелкой аппаратуры, красок, реактивов, посуды, инструментов и т. п. Столы обычно устанавливают перед окнами. Они должны быть устойчивыми, удобными, высотой 80 см, с закраинкой. Поверхность столов покрывают пластиком или линолеумом, стеклом или белой специальной краской. На столе размещают микроскоп, а также необходимые предметы для бактериологической работы.

Бактериологический метод исследования, как правило, вклю­чает микроскопию, выделение и изучение свойств чистой культу­ры возбудителя болезни и заражение лабораторных животных (биологическую пробу). Результаты бактериологического анализа за подписью заведующего отделением или директора лаборатории сообщают только официальным лицам: ветеринарному врачу, зоо-инженеру, руководителю предприятия.

Оборудование микробиологической лаборатории.

Для работы в лаборатории необходимы следующие приборы и аппараты: биоло­гические иммерсионные микроскопы с дополнительными при­способлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство, тем-нопольный конденсор и др.), люминесцентные микроскопы, тер­мостаты, аппаратура для стерилизации, рН-метры, аппараты для

получения дистиллированной воды (дистиллятор), центрифуги, технические и аналитические весы, аппаратура для фильтрования (фильтр Зейтца и др.), водяные бани, холодильники, аппарат для изготовления ватно-марлевых пробок, набор инструментов (бак­териологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.), лабора­торная посуда (пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флако­ны, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки) и др.

В лаборатории выделено специальное место для окраски мик­роскопических препаратов, где находятся растворы специальных красителей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой, бан­кой с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препарата­ми и другими лабораторными материалами. В крупных лаборато­риях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки серологических реакций.

Для выращивания, хранения культур, стерилизации лаборатор­ной посуды и других целей предназначена следующая аппаратура:

1. 
   Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов составляет 37 "С. Термостаты бывают воздушшными и водяными.
2. 
   Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.
3. 
   Холодильники. Используют в микробиологических лабора­ториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, сывороток, вакцин и прочих биологических препара­тов при температуре около 4 °С. Для хранения препаратов ниже 0°С предназначены низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура -20 "С и ниже.
4. 
   Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганизмов, эритроцитов и других клеток, разделения неоднородных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях используют центрифуги с различными режимами работы.
5. 
   Сушильно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Пред­назначен для воздушной стерилизации лабораторной посуды и других материалов.
6. 
   Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для стери­лизации паром под давлением. В микробиологических лаборато­риях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, го­ризонтальные, стационарные, переносные).

Правила работы в микробиологической лаборатории.

Микробио­лог имеет дело преимущественно с чистыми культурами микроор­ганизмов, которые являются потомством одной клетки. Посколь­ку в воздухе и на поверхности предметов в лаборатории (на столах, приборах, инструментах, а также на одежде, руках и др.) всегда присутствует множество разнообразных микроорганизмов, следу­ет постоянно заботиться о сохранении чистоты изучаемых куль­тур. Поэтому при работе в микробиологической лаборатории не­обходимо строго соблюдать определенные правила, одно из кото­рых - поддержание чистоты, включая ежедневную гигиеническую уборку всех помещений.

Для уничтожения микроорганизмов в воздухе и на поверхнос­тях существуют различные способы дезинфекции.

Воздух в лаборатории частично очищают проветриванием. Вентиляция резко снижает численность микроорганизмов в воз­духе, особенно при значительной разнице температур снаружи и внутри помещения. Продолжительность проветривания не менее 30...60 мин.

Более эффективный и наиболее часто применяемый способ обеззараживания воздуха - воздействие ультрафиолетовым излу­чением (УФИ), обладающим высоким антимикробным действием и вызывающим гибель не только вегетативных клеток, но и спор микроорганизмов. Из-за слабой проникающей способности ульт­рафиолетовое излучение не проходит через обычное стекло и лег­ко поглощается частицами пыли. Поэтому для стерилизации вре­мя облучения составляет от 30 мин до нескольких часов в зависи­мости от степени загрязненности воздуха.

В качестве источника УФИ используют бактерицидные лампы (УФЛ). Излучателем в них служит электрическая дуга, возникаю­щая в парах ртути низкого давления и испускающая линейный спектр в ультрафиолетовой области, более 80 % энергии которого приходится на длину волны 2,5 нм.

Бактерицидная лампа представляет собой стеклянную трубку, вмонтированную между двумя электрическими контактами и включаемую в сеть через дроссель. Трубка изготовлена из специ­ального стекла, пропускающего все лучи с длиной волны 2,5 нм и задерживающего излучение с длиной волны короче 2 нм. Следует помнить, что УФИ вызывает острое воспаление роговицы глаз с характерным слезотечением и светобоязнью вскоре после облуче­ния. Поэтому для того чтобы прямые или отраженные ультрафио­летовые лучи не воздействовали на глаза, применяют защитные очки. В небольших помещениях при включенной бактерицидной лампе находиться нельзя.

Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории про­тирают растворами различных дезинфицирующих веществ. Обра­ботка пылесосом удаляет с предметов пыль и значительную часть микрофлоры. В качестве дезинфицирующих растворов чаще всего используют 0,5...3%-й водный раствор хлорамина. Особенно тща­тельно следует дезинфицировать поверхность стола, на котором проводится работа с микроорганизмами. Ее необходимо проти­рать дезинфицирующим раствором как перед началом работы, так и после окончания. На рабочем столе недопустимы лишние предметы. Все реактивы и растворы должны быть снабжены этикетка­ми и стоять на строго определенных местах. В лаборатории нельзя есть, пить, курить. Работать следует в халатах.

В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на плотных и в жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы или чашки Петри. Посуду и питательные среды предварительно стерилизуют. Внесение клеток микроорганизмов в стерильную среду называют посевом, или инокуляцией. Посев (или пересев) микроорганизмов требует четкого соблюдения оп­ределенных правил, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами.

Посевы микроорганизмов в стерильные среды лучше всего осу­ществлять в особых помещениях - боксах. Бокс представляет со­бой небольшую изолированную комнату, разделенную перегород­кой на две части. В основное рабочее помещение бокса входят че­рез тамбур, имеющий раздвижную дверь, что исключает резкое перемещение воздуха и, следовательно, занесение извне посто­ронней микрофлоры. Оборудование бокса включает стол с легко-моющейся поверхностью, стул, газовую или спиртовую горелки, бактерицидную лампу, укрепленную в специальном штативе или смонтированную на потолке бокса. В боксе удобно иметь подсоб­ный стол, на котором размешают необходимые во время работы предметы. Все оборудование бокса, его стены, пол и потолок пе­риодически моют и протирают дезинфицирующими растворами. Перед работой бокс облучают бактерицидной лампой в течение 40...60 мин.

После посева пробирки или другие сосуды, в которых выращи­вают микроорганизмы, помещают в термостаты, где с помощью терморегуляторов поддерживается постоянная температура. Посу­ду с культурами микроорганизмов, подлежащими утилизации, подвергают автоклавированию, чтобы убить клетки, и только пос­ле этого моют. В посуду с плотными средами заливают дезинфи­цирующий раствор, который через сутки удаляют, а посуду моют. Неаккуратное обращение с культурами микроорганизмов приво­дит к возникновению бактериального аэрозоля, представляющего опасность для здоровья сотрудников.

Все сотрудники лабораторий, а также кафедр микробиологии, аспиранты, студенты, приходящие на занятия и работающие в на­учно-студенческих кружках, прежде чем приступить к работе с за­разным материалом (культуры патогенных микробов, трупы экс­периментально зараженных животных, выделения больных жи­вотных, кровь и др.) обязаны ознакомиться и строго соблюдать следующие правила работы и техники безопасности в ветеринар­ных бактериологических лабораториях:

в помещение лаборатории входят только в специальной одеж­де: в халате, белой шапочке или косынке. Халат должен быть на­глухо застегнут, волосы убраны под шапочку;

в лабораторию нельзя проносить посторонние веши, продукты питания. Портфели и сумки складывают в специально выделен­ном месте;

в помещении лаборатории категорически запрещается прини­мать пищу, пить и курить;

каждому работнику (студенту) под определенным номером вы­деляют рабочее место, микроскоп и другие принадлежности;

на рабочем месте должно находиться оборудование только для выполнения конкретного задания. Обычно это набор красок, кол­ба с дистиллированной водой, сливная чашка, банки с чистыми и отработанными стеклами, бактериологическая петля, штатив, банка с дезинфицирующим раствором;

перед началом работы необходимо проверить наличие и ис­правность приборов, посуды, газовых горелок (спиртовок) и пр. О замеченных недостатках и неисправностях следует сообщить от­ветственному, а на учебных занятиях - преподавателю;

во избежание взрыва нельзя зажигать одну спиртовку (или га­зовую горелку) от другой; пользуются только спичками;

нельзя касаться проводов и контактных частей электросети ме­таллическими и другими предметами;

студенты без ведома преподавателя или обслуживающего пер­сонала не должны включать электроприборы и аппаратуру;

студенты приступают к выполнению задания только с разреше­ния преподавателя; ход работы должен строго соответствовать изучаемой методике;

каждый: сотрудник и студент должен соблюдать опрятность в работе, содержать в чистоте рабочее место и оборудование;

материал, используемый на учебных занятиях, принимают за особо опасный;

при распаковке материала, присланного для исследования, необ­ходимо соблюдать осторожность: банки снаружи обтирают дезинфи­цирующим раствором и ставят только на подносы или кюветы;

при исследовании поступившего материала и при работе с бак­териальными культурами соблюдают общепринятые в бактерио­логической практике технические приемы, исключающие воз­можность инфицирования работника;

в процессе изучения возбудителей инфекционных болезней студенты должны усвоить особенности правил техники безопас­ности при работе с конкретными возбудителями;

вскрытие трупов экспериментальных (лабораторных) живот­ных производят в специальной одежде на оборудованном столе с помощью необходимых инструментов, используя для этих целей кювету, залитую воском (или парафином). Инструменты после вскрытия на стол класть запрещается: их помещают в стакан с дез-раствором или обжигают над пламенем горелки;

при работе с жидким инфицированным материалом использу­ют резиновые баллоны, соединенные с пипеткой;

если в процессе работы патологический материал случайно по­пал на стол, его немедленно удаляют тампоном, смоченным де­зинфицирующим раствором. При попадании зараженного мате­риала на кожу, конъюнктиву, в ротовую полость принимают экст­ренные меры к обеззараживанию;

по окончании работы патологический материал, использован­ные культуры микроорганизмов, инструменты и поверхность сто­ла обеззараживают;

в конце занятия бактериальные культуры и другой материал студенты должны сдать преподавателю, а рабочее место привести в порядок. Выносить из лаборатории пробирки с культурами, пре­параты (мазки) и другие предметы категорически запрещается;

патологический материал и бактериальные культуры, необхо­димые для дальнейшей работы, оставляют на хранение в закрытом рефрижераторе или сейфе;

перед уходом из лаборатории необходимо снять халат, руки тщательно вымыть и обработать йодированным спиртом. Выхо­дить за пределы лаборатории в халатах запрещается;

соблюдение правил работы и техники безопасности на учебных занятиях по микробиологии контролируют дежурные. С техникой безопасности при работе на кафедре микробиологии студенты знакомятся на первом занятии, о чем расписываются в журнале.

Соблюдая перечисленные правила, сотрудник в лаборатории обеспечивает стерильность манипуляций и предупреждает воз­никновение внутри- и внелабораторного заражения.

Ведение лабораторных записей. Тетрадь для лабораторных работ служит документом, позволяющим контролиро­вать правильность полученных данных. В нее должны быть занесены сведения, имеющие отношение к выполнению данной работы. За­пись необходимо вести аккуратно, четко и в определенном порядке, например: 1) название опыта, дата его постановки и окончания; 2) объект исследования; 3) условия проведения опыта; 4) основной принцип используемого метода анализа; 5) результаты опыта.

Полученные результаты подробно описывают, цифровой мате­риал сводят в таблицы, если необходимо, в графики, диаграммы, рисунки. Каждая лабораторная работа должна заканчиваться соб­ственными наблюдениями и выводами, занесенными в рабочую тетрадь.

В процессе работы студенты овладевают техникой и методами микроскопирования, знакомятся с морфологией представителей различных групп микроорганизмов, осваивают подход к выделе­нию чистых культур и их идентификации, изучают влияние усло­вий и факторов среды обитания на рост и образование разнообраз­ных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов и знакомятся с некоторыми методами генетических исследований бактерий.

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Транскрипт

1 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию Московский государственный университет инженерной экологии Кустова Н.А. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ Москва 2005

2 Лабораторный практикум по микробиологии предназначен для студентов специальностей 3207 и 3302 по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии», а также для студентов кафедры «Экологическая и промышленная биотехнология» по дисциплине «Экологическая и промышленная микробиология». Практикум состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен вопросам общей микробиологии. В работах этого раздела изучаются морфологическое строение разных групп микроорганизмов, методы микроскопического исследования, техника микробиологических посевов, методы стерилизации и методы количественного учета микроорганизмов. Второй раздел содержит работы по использованию микробов в биотехнологии для получения различных веществ органических кислот, спиртов, антибиотиков, ферментов. В работах третьего раздела изучаются вопросы экологической микробиологии. Часть работ показывает роль микроорганизмов в глобальных биогеохимических циклах, а остальные посвящены проблемам биотехнологической охраны окружающей среды. Каждая тема содержит теоретическое введение и практическую часть, в которой даются описание применяемых методов, порядок выполнения работы, содержание отчета по работе, а также контрольные вопросы. 2

3 ПРЕДИСЛОВИЕ Лабораторный практикум по микробиологии предназначен для студентов 3 курса специальностей 3207 и 3302 по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии», а также для студентов 4 курса кафедры «Экологическая и промышленная биотехнология» по специализации «Биотехнологическая защита окружающей среды» по дисциплине «Экологическая и промышленная микробиология». В основу Лабораторного практикума положены «Методические указания к лабораторным работам» под ред. П.И.Николаева, которые использовались на кафедре «Процессы и аппараты микробиологических производств» с момента создания кафедры. В преподавание микробиологии при обучении инженеров для микробиологической промышленности огромный вклад внесла с.н.с., к.б.н. Н.В.Поморцева. Методические указания были подготовлены под ее руководством научными сотрудниками кафедры: М.А.Боруздиной, И.Е.Ломовой, Н.А.Кустовой, Т.А.Махоткиной и К.А.Соловьевой. Изменение учебной программы в соответствии с новой специальностью инженер-эколог вызвало необходимость расширить курс микробиологии и дополнить его задачами по биотехнологическим методам защиты окружающей среды. Лабораторный практикум состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен общей микробиологии: морфологии микроорганизмов, методам ее изучения, технике микробиологических посевов, методам количественного учета микроорганизмов. Второй раздел охватывает некоторые примеры использования микробов в промышленности. Третий раздел освещает вопросы экологии микроорганизмов, их роль в глобальных циклах элементов, а также в биотехнологических способах охраны окружающей среды. В составлении данного практикума приняли участие аспирант кафедры Н.В.Зябрева и с.н.с. Е.С.Горшина. Автор выражает глубокую благодарность доц. каф. микробиологии МГУ Н.Н. Колотиловой за ценные замечания и советы, а также с.н.с. П.П.Макееву за помощь в оформлении текста и иллюстративного материала. 3

4 4 ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Правила работы и поведения в лаборатории Правила работы и поведения в микробиологической лаборатории имеют много общего с правилами работы в химических лабораториях, но имеют свою специфику. Микробиолог в большинстве случаев работает с чистыми культурами микроорганизмов, т.е. с микроорганизмами какого-либо одного рода, вида и штамма. Поскольку на всех окружающих предметах и в воздухе находятся посторонние микробы, применяются специальные методы работы, чтобы избежать заражения исследуемой культуры микроорганизма или самого человека. Для этого питательные среды, посуду, инструменты стерилизуют, лабораторию и рабочие места содержат в чистоте, соблюдают определенные правила при работе с микробами. В лаборатории не должно быть никаких лишних предметов. Следует регулярно проводить влажную уборку. Различные поверхности лабораторных помещений периодически подвергают дезинфекции. Дезинфекция это обеззараживание, т.е. уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды. Для этого используют 0,5 3%-ный раствор хлорамина или 3 5%-ный раствор фенола (карболовая кислота). Рабочий стол следует дезинфицировать 70%-ным раствором этилового или изопропилового спирта. Дезинфекция воздуха достигается простым проветриванием (не менее мин). Более эффективный способ дезинфекции воздуха облучение помещения ультрафиолетовыми лучами с помощью бактерицидных ламп. Особенно часто ультрафиолетовое облучение применяется для стерилизации бокса. Бокс специальное небольшое помещение для пересевов чистых культур, количественного учета микроорганизмов на чашках Петри и некоторых других работ, требующих особо чистых условий. Перед работой бокс облучают в течение мин. Стол протирают спиртом, стены и пол периодически моют. Вместо бокса лаборатории могут оснащаться ламинарными шкафами (рис. 1), которые также стерилизуются бактерицидными лампами. При

5 работе включают вентилятор для создания ламинарного потока стерильного воздуха, пропущенного через бактерицидные фильтры. Основное оборудование микробиологической лаборатории включает в себя: микроскопы, термостаты для выращивания микроорганизмов, аппаратуру для стерилизации (автоклав и сушильный шкаф), центрифуги, дистиллятор, холодильник для хранения музейных культур микроорганизмов, шкафы для размещения стеклянной посуды и реактивов, необходимые приборы (фотоэлектроколориметры, рн-метры и т.д.). За каждым студентом закрепляют рабочее место, на котором размещают: микроскоп, закрываемый чехлом, бактериологическую петлю, предметные и покровные стекла, стерильные пипетки, спиртовую горелку, полоски фильтровальной бумаги, маркер по стеклу, сосуд с дезинфицирующей жидкостью. На столе не должно быть ничего, не относящегося непосредственно к выполнению работы. На лабораторных занятиях по микробиологии следует соблюдать правила техники безопасности. 5

6 6 Краткие сведения по технике безопасности в лаборатории В микробиологической практике широко применяется посуда из химического стекла. Надо соблюдать осторожность при работе с ней. Осколки разбитой посуды тщательно убирать. При анализах часто применяются крепкие растворы щелочей и кислот. Работать с ними нужно с большой осторожностью, так как эти вещества вредно действуют на кожу рук и одежду. Если кислота случайно пролилась, ее надо засыпать большим количеством соды и затем несколько раз промыть водой. Пролившуюся щелочь надо тщательно вытереть, а предметы, на которые она попала, обработать слабым раствором уксусной кислоты. При попадании кислот или щелочей на кожу человека их необходимо тотчас же смыть большим количеством воды. В микробиологической лаборатории имеют дело с живыми микроорганизмами. Основные работы ведутся стерильно, т.е. работают с одной культурой микроорганизмов, которая не должна заражаться посторонними микробами. Для предупреждения заражения посевов применяют специальные методы стерилизации. Кроме того, важно соблюдать чистоту в лаборатории. Посуда с культурами микроорганизмов не должна оставаться открытой. Биомасса микроорганизмов, если она не нужна для анализов, выбрасывается только после стерилизации в автоклаве. Посевы микроорганизмов производят у пламени газовой или спиртовой горелки, поэтому следует остерегаться ожогов, и прежде всего аккуратно подобрать длинные волосы. Горелка должна гореть только тогда, когда это необходимо. Если при посеве случайно загорится ватная пробка, спиртовка или бумага, огонь гасят полотенцем. При более крупных очагах загорания пользуются огнетушителями. Использованные пипетки, предметные и покровные стекла, шпатели и т.д. помещают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью. Студенты должны постоянно помнить, что они имеют дело с микроорганизмами, которые далеко не всегда могут быть безопасными, особенно в работах по выделению микробов из объектов окружающей среды. Поэтому в конце занятия студенты должны привести в порядок рабочее место и вымыть руки с мылом.

7 При неисправности электрической сети нужно выключить электроприборы и их централизованное электропитание. РАЗДЕЛ 1. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ТЕМА 1. Морфология микроорганизмов и методы ее изучения Микробиология изучает организмы, которые имеют микроскопические размеры, т.е. измеряются микрометрами или долями микрометров. Один микрометр равен 10-6 метра и сокращенно обозначается мкм. Микроорганизмы характеризуются интенсивным обменом веществ и способны осуществлять разнообразные химические превращения. Разные микроорганизмы отличаются и по своему строению и по тем биохимическим процессам, которые они осуществляют. Объединение их в одну группу вызвано не только малыми размерами, но и общностью методов культивирования и исследования. Для изучения строения микроорганизмов, их внешнего вида, формы, размеров, т.е. для изучения морфологии микроорганизмов, пользуются микроскопом. Наименьшие частицы, которые удается увидеть в современные световые микроскопы, имеют величину более 1/3 длины волны света, т.е. не менее 0,2 мкм, что связано с использованием видимой части света, имеющего длину волны от 0,4 мкм до 0,7 мкм. Устройство микроскопа На рис. 2 показан внешний вид распространенного в научноисследовательской и учебной практике микроскопа МБИ-3. Рассматриваемый объект препарат помещается на предметный столик и освещается снизу лучами света, которые выходят из осветителя, падают на зеркало, затем проходят через конденсор и фокусируется на препарате. Основные части микроскопа: окуляры, тубус, револьверная насадка с объективами, предметный столик с зажимами для препаратов, конденсор, макрои микровинты для наведения на резкость и, наконец, штатив, в который все это вмонтировано. 7

8 Перед микроскопированием проверяют правильность установки освещения (по Келеру). Для этого, перемещая патрон осветителя с лампочкой, добиваются четкого изображения нити 8

9 накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора. Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают накал нити лампы. И, наконец, изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все поле зрения. Микроскоп представляет собой оптическую систему с двумя ступенями увеличения: первое увеличение осуществляется объективом, второе окуляром. Объектив дает увеличенное обратное изображение предмета, которое рассматривается в окуляр. В результате глаз наблюдателя видит сильно увеличенное обратное изображение предмета. Поэтому движение объекта налево воспринимается глазом как движение направо. Общее увеличение микроскопа, т.е. увеличение, при котором рассматривают объект под микроскопом, определяется как произведение увеличений объектива и окуляра. Объективы дают увеличение в 10, 40, 60, 90 раз, окуляры в раз. Если применяется бинокулярная насадка, она дает дополнительное увеличение. На рис. 3 показана принципиальная схема оптической системы микроскопа. Объектив О образует в плоскости Z действительное перевернутое изображение А объекта А. Даваемое объективом изображение увеличивается далее при помощи окуляра Е. Так как Z находится в фокусе окуляра Е, наблюдатель видит увеличенное мнимое изображение А в плоскости Х, которая обычно располагается в 25 см от глаза, т.е. на расстоянии, наиболее удобном для ближнего зрения. Следует иметь в виду, что подобное представление о механизме образования изображения является в высшей степени упрощенным, ибо оно игнорирует влияние дифракции и ряда других факторов. В работе с микроскопом студенты изучают препараты микробов с увеличением в раз. Наибольшее увеличение, которое дает оптический микроскоп, 3000 раз. Наименьший размер частиц, которые можно рассматривать в таком микроскопе, 9

10 равен 0,2 мкм, что обусловлено длиной волны видимой части спектра. Морфология микроорганизмов Мир микроорганизмов включает в себя огромное разнообразие форм, которые не составляют единую систематическую группу. Основными объектами микробиологии являются бактерии, но кроме них микробиологи изучают еще дрожжи, грибы, микроскопические водоросли и некоторые простейшие. На рис. 4 представлены основные группы микроорганизмов (за исключением простейших); соотношения их размеров сохранены. Все живые организмы, кроме вирусов, имеют клеточное строение. В соответствии со своей клеточной организацией они делятся на прокариотные и эукариотные. 10

11 Главное отличие эукариот от прокариот состоит в наличии вторичных полостей, отделяющих ядро и другие клеточные структуры от цитоплазмы. Именно появление вторичных полостей позволило совершить скачок в эволюции всего живого мира за счет увеличения внутренней поверхности мембран эукариот. Это дало возможность в соответствии с увеличением скорости диффузии, одновременно осуществлять большее количество протекающих на мембранах биохимических реакций. Прокариотами являются бактерии, в том числе актиномицеты и цианобактерии. Эукариотами все растения, животные, дрожжи, грибы, простейшие. Среди прокариот в настоящее время выделяется группа архебактерий, которая включает в себя метаногенов, экстремальных галофилов, (живущих в очень соленой воде) экстремально термофильных бактерий, окисляющих и восстанавливающих молекулярную серу, а также термоплазм, лишенных клеточной стенки. Новое разделение было сделано на основе сравнения нуклеотидных последовательностей в малых отрезках рибосомных РНК. 11

12 Архебактерии отличаются по составу клеточных стенок, липидов и некоторых других физиолого-биохимических особенностей (например, у них другой механизм фиксации СО 2). Таким образом, в строении клеточной организации в настоящее время выделяют 3 группы: архебактерии, (по новой номенклатуре Archaea, археи), эубактерии (по новой номенклатуре Bacteria, бактерии), и эукариоты (по новой номенклатуре Eukarya). Работа 1. Микроскопическое изучение бактерий Морфология бактерий Теоретическое введение Эта группа микроорганизмов наиболее многочисленна, широко распространена в природе и имеет большое промышленное значение. Для наименования микроорганизмов используют бинарную номенклатуру, как в зоологии и ботанике. В соответствии с этой номенклатурой каждый вид имеет название, состоящее из двух латинских слов. Первое слово означает род, а второе вид. Родовое название всегда пишется с заглавной буквы, а видовое со строчной. Большинство бактерий одноклеточные организмы сферической, палочковидной или извитой формы. Среди бактерий есть небольшое количество нитчатых форм. Бактерии очень малы, диаметр клетки шаровидных бактерий составляет 1 2 мкм. Размножаются бактерии делением (при благоприятных условиях деление происходит через мин). Некоторые бактерии подвижны. Способность двигаться связана с наличием особых органелл жгутиков. Наиболее просты по форме шаровидные бактерии (кокки). Они встречаются или в виде единичных шариков, или шариков, сцепленных между собой. По расположению клеток после деления шаровидные бактерии подразделяют на монококки (единичные кокки), тетракокки (объединены по 4), сарцины (объединены по 8), стафилококки (гроздья), стрептококки (цепочки кокков). 12

13 Палочковидные бактерии представляют собой самую многочисленную группу бактерий. Они имеют цилиндрическую форму клеток с округлыми или заостренными концами и в сильной степени различаются по отношению длины к ширине. Они могут располагаться одиночно либо образуют короткие или длинные цепочки. Палочки могут быть различной длины, обычно несколько мкм, а ширина около 1 мкм. Некоторые палочковидные бактерии образуют внутри клетки особые тельца споры. Каждая клетка образует одну спору, которая служит для перенесения неблагоприятных условий. Спора при соответствующих условиях (температура, влажность, питательные вещества) прорастает, превращаясь в палочку. Стойкость бактериальных спор превосходит стойкость любых живых организмов. Например, спора сенной палочки Bacillus subtilis выдерживает температуру 100 О С в течение 3 ч. Такая устойчивость спор затрудняет борьбу с инфекциями. Извитые микроорганизмы различаются по степени изогнутости клеток и по числу витков. Они разделяются на вибрионы, спириллы и спирохеты. Если у бактерии один неполный завиток спирали, то она называется вибрионом. Если бактерия имеет несколько спиралевидных завитков, то ее называют спириллой, а микробов, имеющих извитую форму с большим количеством мелких завитков, называют спирохетами. Нитчатые бактерии представляют собой нити, состоящие из цилиндрических или дисковидных клеток. Нити некоторых видов заключены в слизистую оболочку, которая может быть пропитана гидроокисью железа или солями марганца. Процесс аккумуляции тяжелых металлов из растворов происходит в клетках некоторых железобактерий. Крупные нитчатые бактерии р. Beggiatoa откладывают в клетках серу. Нитчатые бактерии обитают обычно в морских и пресных водах, встречаются также в разлагающихся органических остатках, в кишечнике животных. К цианобактериям относится большая группа организмов, сочетающих прокариотное строение клетки со способностью осуществлять фотосинтез. Пигменты клеток цианобактерий помимо хлорофилла а (зеленого цвета) содержат фикоцианин пигмент 13

14 синего цвета. По этому признаку раньше их называли синезелеными водорослями. Большинство из них многоклеточные организмы, представляющие собой длинные, чаще всего неразвлетвленные нити (трихомы). Клетки в нитях объединены общей наружной стенкой. Иногда образуют слизистые скопления «маты». Размножение осуществляется путем распада нити на отдельные участки. Некоторые виды передвигаются скольжением (р. Spirulina). Актиномицеты (ветвящиеся бактерии, лучистые грибки) большая группа прокариотных микроорганизмов, которая образует тонкие ветвящиеся нити длиной в несколько мм и диаметром 0,5 1,5 мкм. Они являются своеобразной группой микроорганизмов, которая в морфологическом отношении имеет сходство с плесневыми грибами (рис. 5). Клетки значительной части представителей этой группы способны ветвиться, что является характерным признаком грибов. Однако длина ветвящихся нитей актиномицетов достигает нескольких миллиметров, тогда как длина мицелия грибов нескольких сантиметров. Гифы грибов обычно в несколько раз толще нитей актиномицетов. По морфологии и развитию актиномицеты разделяются на высшие и низшие формы. К высшим относятся организмы с хорошо 14

15 развитым септированным или несептированным мицелием и особыми органами спороношения. Споры образуются в виде цепочек на специальных спороносящих гифах воздушного мицелия. Строение органов спороношения различно у разных видов: длинные или короткие, прямые или спиралевидные (рис. 6). По наличию мицелия и строению органов спороношения высшие актиномицеты напоминают мицелиальные грибы. Некоторые актиномицеты имеют мицелий только в молодой культуре, который с возрастом распадается с образованием палочковидных и кокковидных клеток. Низшие формы актиномицетов не имеют истинного мицелия. Способность к образованию мицелия выражена у них лишь в тенденции клеток к ветвлению. К низшим актиномицетам относятся, например, виды рода Mycobacterium, которые обладают свойством менять форму клеток с возрастом культуры (рис. 7). Это свойство называется плеоморфизм. Среди высших актиномицетов ведущее место по численности в природных средах занимают виды рода Streptomyces. Актиномицеты играют большую роль в процессах 15

16 почвообразования и создания плодородия почв. Актиномицеты разрушают сложные органические соединения (целлюлозу, гумус, хитин, лигнин и др.), недоступные многим другим микроорганизмам. Почти все виды рода Streptomyces образуют специфические продукты жизнедеятельности, обладающие антибиотическими свойствами. Некоторые виды являются возбудителями заболеваний растений, животных и человека. Помимо основных форм бактерий существуют cтебельковые и почкующиеся бактерии, несущие выросты, получившие название простек. (рис.8) 16

17 Функции простек различны. У некоторых бактерий они служат для размножения, у других для прикрепления клетки к субстрату. 17

18 18 Практическая часть Цель работы изучить морфологию представителей бактерий Порядок выполнения работы Выполняя первую работу, студенты учатся обращению с микроскопом, просматривают готовые препараты представителей бактерий, затем самостоятельно готовят препараты живых бактерий и микроскопируют их. Сначала студенты микроскопируют готовые фиксированные препараты бактерий. Фиксированные препараты представляют собой микроорганизмы, суспендированные в водной среде, высушенные на предметном стекле и окрашенные анилиновыми красителями. Препараты некоторых живых микроорганизмов студенты готовят самостоятельно. Для этого на чистое предметное стекло наносится небольшая капля водопроводной воды, в которую прокаленной и остуженной бактериологической петлей вносится небольшое количество исследуемых микробов, тщательно размешивается и накрывается покровным стеклом. Избыток воды снимается фильтровальной бумагой. Препарат помещается на предметный столик и закрепляется зажимами. Сначала, глядя в окуляр и вращая макровинт, добиваются резкого изображения объекта при малом увеличении с объективом 10х. Затем переводят микроскоп на большое увеличение с объективом 40х. Вращение винтов надо производить с осторожностью, так как при слишком резком опускании можно раздавить линзы объективом. При микроскопировании следует иметь в виду, что микроскоп, особенно при больших увеличениях, не захватывает всей глубины объекта, поэтому при постепенном опускании тубуса с помощью микровинта объект виден сначала сверху, а потом в оптическом разрезе. 1. Просмотр фиксированных препаратов микроорганизмов. Lactococcus lactis возбудитель молочнокислого брожения; форма клеток шаровидная кокки; клетки соединены в цепочки. Используется для получения молочнокислых продуктов.

19 Lactobacillus acidophilum палочковидные бактерии; возбудитель молочнокислого брожения. Используется для получения молочнокислых продуктов. Acetobacter aceti палочковидные бактерии, окисляющие этанол в уксусную кислоту. Используется для получения пищевого уксуса. Streptomyces griseus актиномицет, форма клетки в виде тонких разветвленных нитей; продуцент антибиотика стрептомицина. Saccacharopolyspora erythrae актиномицет, форма клетки в виде тонких разветвленных нитей; продуцент антибиотика эритромицина. 2. Просмотр живых препаратов Bacillus subtillis форма клеток в виде тонких подвижных палочек; образует споры; продуцент ферментных препаратов. Spirulina platensis цианобактерия; форма клеток в виде одиночной нити, состоящей из цилиндрических клеток, плотно прилегающих друг к другу; обладает скользящим движением. Применяется в виде пищевой добавки. Содержание отчета 1. Латинское название микроорганизма. 2. Морфология клетки (дать рисунок с указанием увеличения микроскопа и сохраняя соотношение размеров клеток). 3. Использование изучаемых бактерий в промышленности. Контрольные вопросы 1. Опишите устройство микроскопа. 2. Как определить увеличение микроскопа? 3. Какова форма клеток бактерий. 4. Назовите особенности морфологии актиномицетов. 5. Каких представителей бактерий Вы знаете и каково их практическое значение? Работа 2. Морфология эукариотных микроорганизмов Теоретическое введение 19

20 К эукариотным микроорганизмам, которые изучаются микробиологами, относятся: грибы, дрожжи, микроводоросли и некоторые простейшие. Морфология грибов Грибы бесхлорофильные микроорганизмы, имеющие нитевидную форму клеток. Длинные разветвленные нити, образуемые ими, называются гифами. Гифы в совокупности образуют мицелий. По своим размерам гифы грибов намного крупнее актиномицетов. Мицелий у ряда плесневых грибов разделен перегородками (септированный мицелий), а других видов перегородки отсутствуют. В биотехнологии в качестве продуцентов, в основном, используются плесневые грибы. Под названием «плесневые грибы» объединяются некоторые представители фикомицетов, сумчатых и несовершенных грибов. На плотных субстратах плесневые грибы образуют округлые пушистые, паутинообразные, ватоподобные или порошкообразные колонии зеленого, желтоватого, черного или белого цвета. Колонии плесеней состоят из большого количества гифов. Большая часть гифов развивается в воздухе, а часть в толще субстрата. На гифах часто образуются конидиеносцы, на которых споры образуются или внутри спорангия или в виде экзоспор расположенных цепочками. Конидиеспоры, или конидии, служат для бесполого размножения (рис. 10). Конидии, попадая в благоприятные условия, прорастают в мицелий. Плесневые грибы очень широко распространены в природе и имеют мощный ферментативный аппарат. Поэтому они являются основными деструкторами органических соединений в природе. Плесневые грибы также широко используются в промышленности для получения органических кислот, антибиотиков и ферментов. 20

21 Морфология дрожжей Дрожжи представляют собой отдельную группу одноклеточных микроскопических грибов, имеющих большое практическое значение. Дрожжевые клетки представляют собой крупные клетки округлой или овальной формы (рис. 11). Некоторые дрожжи могут образовывать рудиментарный мицелий, который называется «псевдомицелий». Размер клеток колеблется от 3 мкм до 10 мкм в длину и от 2 до 8 мкм в ширину. Большинство дрожжей размножаются почкованием. При этом на 21

22 поверхности клетки появляется небольшая выпуклость почка (иногда не одна, а несколько), постепенно увеличивающаяся в размерах и, наконец, отделяющаяся от производящей ее клетки. Отделившаяся от материнской клетки почка становится новой дрожжевой клеткой. Некоторые дрожжи размножаются делением. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей (протоплазме) хорошо заметны крупные вакуоли. Вакуоли представляют собой полости внутри протоплазмы, заполненные клеточным соком. Он состоит из растворенных в воде электролитов, белков, углеводов и ферментов. В молодых дрожжевых клетках протоплазма гомогенная, а на более поздних стадиях развития в протоплазме появляются вакуоли, заполненные клеточным соком с продуктами обмена веществ. При истощении питательной среды у многих дрожжей наступает спорообразование. У некоторых видов дрожжей споры округлой формы и покрыты гладкой оболочкой. В благоприятных условиях споры прорастают. Дрожжи широко распространены в природе. Они встречаются на винограде, на других ягодах и фруктах, в молоке, в воде и почве, а также на коже человека. Многие дрожжи осуществляют спиртовое брожение и применяются для производства спирта в хлебопечении, виноделии, пивоварении. 22 Морфология простейших Простейшие представляют собой одноклеточные организмы животного мира. Среди микроорганизмов они являются наиболее сложно устроенными, имеющими примитивные органы, свойственные многоклеточным животным. У некоторых из них имеются ротовое и анальное отверстия, сократительные и пищеварительные вакуоли. Размножаются простейшие бесполым (делением клетки) и половым путем. Классификация простейших основана на способах движения. 1. Саркодовые. Передвигаются и захватывают пищу с помощью псевдоподий, или ложных ножек. Типичным представителем является Amoeba. Размеры амеб не превышают мкм.

23 2. Жгутиковые. Имеют плотную плазматическую оболочку и передвигаются с помощью жгутиков. Почвенные формы жгутиков очень мелкие (2 5 мкм), а водные крупные (до 20 мкм). Типичным представителем является Euglena. 3. Ресничные. Наиболее высокоорганизованные простейшие. Размеры клеток колеблются от 20 до 80 мкм. Типичным представителем является инфузория-туфелька Paramecium, которую культивируют на корм малькам рыб. 4. Споровики. Неподвижные формы. Многие патогенны, например возбудитель малярии Plasmodium. Простейшие широко распространены в природе. Они встречаются в водоемах, в иле и почве. Значение простейших в природе весьма разнообразно. Они живут в желудочно-кишечном тракте различных животных, принимая участие в переваривании растительной пищи, участвуют в минерализации органических остатков в почве, а также являются важной составляющей частью биоценоза в очистных сооружениях. Питаясь бактериями и взвешенными веществами, они способствуют осветлению воды. Простейшие выполняют функцию индикаторов: по развитию тех или иных форм можно судить о качестве очистки стоков. Так, преобладание амеб и отсутствие в составе активного ила инфузорий свидетельствует о плохой работе очистных сооружений. Инфузория Tetrahymena широко используется для первичной оценки токсичности. Различные виды простейших представлены на рис. 12. Морфология водорослей Водоросли представляют собой обширную группу растительных организмов. Общее для всех них наличие хлорофилла и обусловленное этим фотоавтотрофное питание способность синтезировать органические вещества, используя энергию солнечного света и углекислый газ. У многих водорослей зеленая окраска хлорофилла замаскирована другими пигментами. Среди них встречаются очень мелкие одноклеточные и многоклеточные формы, относимые к микроорганизмам, а также 23

24 многоклеточные организмы, обитающие в морях и океанах и достигающие иногда гигантских размеров.. Объектами изучения микробиологии являются некоторые водоросли микроскопических размеров. Они имеют разнообразную форму и обитают как на суше, так и в водной среде (рис. 13). 24

25 Практическая часть Цель работы изучить морфологию представителей различных групп эукариотов. Порядок выполнения работы Студенты самостоятельно готовят живые препараты представителей грибов, дрожжей, водорослей и простейших; микроскопируют их с объективом х40 и зарисовывают с указанием увеличения микроскопа. Плесневые грибы Aspergillus niger форма клеток в виде мицелия с перегородками; на некоторых гифах имеются неразветвленные конидиеносцы со спорами. Конидиеносцы одноклеточные, шаровидно вздутые, на поверхности вздутия расположены короткие кеглеобразные клетки (стеригмы), каждая из которых отшнуровывает по цепочке конидий, окрашенных в черный цвет. Применяется для получения органических кислот и ферментов. Penicillium chrysogenum гифы имеют перегородки; на некоторых гифах имеются разветвленные конидиеносцы со спорами. Конидии образуются на концах мутовчато разветвленных конидиеносцев. Применяется для получения антибиотика пенициллина. 25

26 Дрожжи Saccharomyces cerevisiae одиночные дрожжи с овальными и округлыми клетками; размножаются почкованием. Применяются в пивоварении, хлебопечении, производстве спирта. В природе встречаются на поверхности ягод и других плодов. Saccharomyces vini форма клеток овальная и округлая; размножаются почкованием; после почкования некоторое время не отделяются, образуя небольшие «веточки». Применяются в виноделии. Rhodotorula glutinis форма клеток эллиптическая; клетки одиночные; размножаются почкованием. Окрашены в оранжевый цвет благодаря содержанию в клетках каротиноидов. Могут расти в средах с углеводородами нефти в качестве источника углерода. Используются как кормовые дрожжи. Candida tropicalis дрожжи с овальными и сильно вытянутыми клетками, образующие «псевдомицелий». Могут расти в минеральной среде с углеводородами в качестве источника углерода. Используются как кормовые дрожжи. В промышленном масштабе выращиваются на отходах производства спирта, бумаги. Водоросли Chlorella vulgaris микроскопическая зеленая водоросль, имеющая округлые клетки (5 10 мкм в диаметре); размножаются автоспорами, которые формируются внутри материнской клетки в количестве от 4 до 32 и освобождаются после разрыва ее оболочки. Могут применяться для массового культивирования с целью получения кормового белка, а также для регенерации воздуха в замкнутых системах (подводные лодки, космические станции и т.д.). Scenedesmus sp. относится к группе зеленых водорослей; имеет овальную форму клеток; наружные клетки часто бывают с заостренными концами; клетки соединены вместе по четыре. Применяется для получения пищевого белка. 26

27 Простейшие Препарат готовится из активного ила аэротенка. Изучить морфологию обнаруженных представителей простейших и зарисовать их. Содержание отчета 4. Латинское название микроорганизма. 5. Морфология клетки (дать рисунок с указанием увеличения микроскопа и сохраняя соотношение размеров клеток). 6. Использование изучаемых микроорганизмов в промышленности. Контрольные вопросы 1. Опишите форму клеток представителей грибов и их практическое использование. 2. Опишите форму клеток дрожжей; назовите представителей, и расскажите об их практическом использовании. 3. Расскажите о морфологии микроводорослей и их практическом использовании. 4. Назовите представителей простейших и расскажите об их применении в биотехнологии. Работа 3. Методы изучения морфологии микроорганизмов Самым распространенным методом изучения морфологии бактерий является микроскопирование фиксированных препаратов, приготовленных из чистых культур микроорганизмов или из исследуемой пробы. Исследование микроорганизмов в живом состоянии применяется при изучении более крупных форм и наблюдении подвижности клеток. Приготовление фиксированных препаратов микроорганизмов Для приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов вначале готовят мазок, высушивают его, фиксируют, а затем окрашивают. Мазки готовят на совершенно чистых предметных стеклах. Обезжиривать стекла можно этиловым спиртом, смесью равных объемов спирта и эфира и другими 27

28 жидкостями. Самым простым и практически удобным способом обезжиривания стекол является протирание их с обеих сторон кусочком хозяйственного мыла. Мыло удаляют со стекла кусочком сухой ваты или салфеткой. При изготовлении мазка из колонии бактерий, выращенных на агаризованной среде, вначале наносят на обезжиренное стекло каплю воды или физиологического раствора. Затем прокаливают бактериологическую петлю в пламени горелки. После этого, охладив петлю на внутренней стенке пробирки, захватывают часть колонии без агара петлей. Петлю с культурой вносят в каплю воды или физиологического раствора на стекле и делают 2 3 круговых движения. Часть бактерий суспендируется в жидкости. Избыток бактерий, оставшихся на петле, сжигают в пламени горелки, нагревая петлю докрасна. Затем охлажденной петлей размазывают каплю суспензии по стеклу. Площадь мазка должна быть в диаметре 1,5 2 см. Мазок должен быть тонким с равномерным распределением материала. Если мазок готовят из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, то, соблюдая те же правила стерильности, набирают каплю культуры петлей или пипеткой и наносят ее на середину обезжиренного стекла. Пипетку с остатком культуры погружают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Каплю равномерно распределяют по стеклу бактериологической петлей. Петлю прожигают в пламени горелки и ставят в штатив или в стакан. Мазок высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха, держа его за продольные ребра высоко над пламенем горелки. Границы мазка очерчивают восковым карандашом с обратной стороны стекла, а со стороны мазка на одном из концов стекла ставят номер препарата. По этим отметкам легко можно ориентироваться в месте расположения мазка на стекле. Высушенный мазок фиксируют. Фиксация преследует следующие цели: 1) убить микробов, что делает препарат безопасным при дальнейшей работе; 2) прикрепить микробов к стеклу, чтобы они не смылись при окраске и промывке водой; 3) улучшить восприимчивость красок. 28

29 Наиболее простым, пригодным почти для всех микробиологических объектов и самым распространенным в практике методом является фиксация в пламени горелки. Для этого предметное стекло проводят 3 4 раза через наиболее горячую верхнюю часть пламени горелки, не допуская излишнего перегревания препарата, чтобы не вызвать денатурации белка и нарушения структуры и морфологии бактерий. Различают простые и сложные дифференциальные методы окраски. Простой окраской пользуются для обнаружения в исследуемом материале микробов, определения их количества, формы и расположения. Простая окраска заключается в нанесении на препарат какой-либо одной анилиновой краски. Чаще всего для этих целей употребляется фуксин красная окраска, а также щелочной раствор метиленовой синьки (синька Леффлера) голубая окраска. Техника окраски: хорошо зафиксированный препарат помещают мазком вверх на стеклянный мостик над ванночкой. На поверхность мазка пипеткой или из капельницы наносят одну из указанных красок. Фуксин выдерживают на мазке 1 3 мин, а синьку 3 5 мин. Краску с мазка сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, помещают препарат на предметный столик микроскопа и микроскопируют с иммерсионным объективом (90) в проходящем свете. Дифференциальные способы окраски бактерий. Сложные методы окраски имеют большое значение при определении и дифференциации различных видов микробов. Они основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки и применяются для детального изучения структуры клетки и выявления отличительных признаков по отношению к некоторым красителям. При этих методах мазок окрашивают несколькими красками и дополнительно обрабатывают протравами или обесцвечивающими веществами спиртом, кислотой и др. К этим методам относят важнейший метод окраски для дифференциации бактерий окраску по Граму. При этом методе выявляется 29

30 способность бактерий удерживать краситель или обесцвечиваться в спирте, что связано с химической структурой клеточной стенки. Все бактерии по строению клеточной стенки делятся на две группы: 1) красящиеся по Граму грамположительные и 2) не красящиеся по Граму грамотрицательные. Отношение к окраске по Граму является настолько важным дифференциальным признаком бактерий, что обязательно упоминается при их характеристике и служит таксономическим признаком. 30 Методика окраски по Граму На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, заранее пропитанной генцианвиолетом. На полоску наносят 3 5 капель водопроводной воды. Через 1 2 мин бумажку удаляют пинцетом, а на препарат наливают раствор Люголя. Через 30 сек 1 мин сливают раствор Люголя. Наносят несколько капель 96 О -ного спирта. Обесцвечивают в течение 1 мин до исчезновения сероватофиолетовых струек. Препарат промывают водой. На мазок наливают фуксин и выдерживают 1 2 мин. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетово-синий (например, палочка маслянокислого брожения Clostridium pasteurianum), а грамотрицательные в розово-красный цвет (кишечная палочка Escherichia сoli). Кроме этой традиционной методики окрашивания по Граму имеется быстрый и простой метод для дифференциации по Граму без окрашивания. Клетки бактерий (лучше 1 2-суточные) помещают петлей в каплю 3%-ного KOH на предметное стекло, размешивают круговыми движениями и через 5 8 с петлю резко поднимают. Суспензия грамотрицательных бактерий становится вязкой и тянется за петлей, образуя слизистые тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределяются в капле щелочи (как в воде). Реакция считается отрицательной, если образования слизистых тяжей не наблюдается в течение 60 с. Увеличение вязкости вызвано лизисом клеточных стенок грамотрицательных бактерий в растворе

31 щелочи и освобождением ДНК. Метод дифференциации бактерий по Граму без окрашивания следует использовать лишь для предварительной диагностики, либо подсчета примерного соотношения колоний грамположительных и грамотрицательных бактерий. Выявление живых и мертвых клеток методом окраски метиленовой синью Число живых и мертвых клеток можно определить методом окраски раствором метиленовой сини. Метод основан на различной проницаемости живых и мертвых клеток микроорганизмов. Клеточная проницаемость у мертвых клеток нарушается, поэтому краситель свободно проходит сквозь цитоплазматическую мембрану и адсорбируется протоплазмой. Под микроскопом мертвые клетки выглядят синими, живые бесцветными или бледноголубыми. Окраска осуществляется следующим образом: на предметное стекло наносится капля 2% раствора метиленовой сини, покрывается покровным стеклом, избыток краски оттягивается кусочком фильтровальной бумаги. Препарат просматривается под микроскопом, в 10 полях зрения считают количество живых и мертвых клеток; число мертвых клеток выражается в %. Пример: среднее число живых клеток в одном поле зрения 10, среднее число мертвых клеток в одном поле зрения 5, общее число клеток в одном поле зрения клеток 100% 5 клеток Х Х 33,3% 15 Таким образом, число мертвых клеток в исследуемой суспензии микроорганизмов составило 33,3%. Определение размеров клеток Для определения размеров клеток микроорганизмов необходимо иметь специальный окуляр со шкалой (окулярный микрометр) и объект-микрометр. Окулярный микрометр, в 31

32 простейшем случае, представляет собой стеклянный диск с нанесенной на нем линейной шкалой, который вкладывается в окуляр (рис. 14а). Объект-микрометр представляет собой предметное стекло, в центре которого выгравирована линейная шкала длиной 1 мм, с ценой деления 10 мкм. Перед измерением необходимо определить цену деления окулярного микрометра для каждого увеличения микроскопа. Для этого объект-микрометр помещается на предметный столик микроскопа и рассматривается как препарат; при этом одно из видимых делений объект-микрометра совмещается с нулевой отметкой шкалы окулярного микрометра и отмечается совпадение делений той и другой шкалы (рис. 15). Подсчитывают, сколько окулярных и объективных делений приходится на этот отрезок, и вычисляют цену делений окулярного микрометра. Если после этого поместить на предметный столик препарат микроорганизмов вместо объект-микрометра и рассматривать его 32

33 при том же увеличении, то можно измерить величину микробной клетки, пользуясь шкалой окулярного микрометра как линейкой. Для точных измерений применяется специальный окулярный микрометр со скользящей нулевой отметкой, связанной с измерительным барабаном (рис. 14б). Он позволяет определить размеры микроорганизмов с точностью до десятых долей микрона. Нулевой отметкой служит двойная вертикальная линия, середина которой соответствует пересечению двух тонких линий в виде креста. Перед измерениями необходимо узнать цену деления шкалы измерительного барабана. Эталоном служит объект-микрометр. Вращая измерительный барабан, нулевой отметкой обводят несколько делений шкалы объект-микрометра. Двойная вертикальная линия показывает число полных оборотов измерительного барабана. Проводя измерения микроорганизмов, передвигают нулевую отметку вдоль объекта и считают показания измерительного барабана. Практическая часть Цель работы освоить основные методы изучения морфологии микроорганизмов. 33

34 Порядок выполнения работы 1. Приготовить фиксированные препараты молочнокислых бактерий из биокефира и ацидофилина. 2. Выполнить окраску по Граму клеток Bacillus subtilis (грам+) и Escherichia coli (грам-). 3. Определить размеры дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. 4. Определить число живых и мертвых клеток Saccharomyces cerevisiae в суспензии дрожжей. 34 Содержание отчета 1. Морфология клеток молочнокислых бактерий (рисунки фиксированных препаратов молочнокислых бактерий с указанием увеличения микроскопа). 2. Рисунки фиксированных препаратов грамотрицательных и грамположительных бактерий. 3. Определение цены деления измерительного барабана окулярного микрометра. 4. Размеры дрожжевой клетки Saccharomyces cerevisiae. 5. Число живых и мертвых клеток в суспензии дрожжей. Контрольные вопросы 1. Как приготовить фиксированный препарат бактерий? 2. С чем связано различие бактерий в окраске по Граму? 3. В чем заключается метод окраски по Граму? 4. Как определить размер микроорганизмов? 5. Как определить количество живых и мертвых клеток микроорганизмов методом окраски метиленовой синью? Тема 2. Культивирование микроорганизмов: принципы составления питательных сред; методы стерилизации; методы посевов и пересевов микроорганизмов. Классификация и приготовление питательных сред Культивировать микроорганизмы это значит искусственно создавать условия для их роста. Для культивирования

35 микроорганизмов в лаборатории или в промышленности применяются питательные среды, содержащие все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов вещества. Из окружающей среды питательные вещества поступают в клетку микроорганизма, а из клетки в среду выводятся продукты обмена. Для жизнедеятельности микроорганизмов необходимы вода, углерод, кислород, азот, сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо и микроэлементы. Все эти вещества должны содержаться в питательной среде. Даже без одного из них роста или совсем не будет или он будет ничтожным. Углерод, водород, азот, фосфор и сера называются биогенными элементами, так как на их долю приходится около 90 95% сухой массы клеток. Калий, магний, кальций и натрий называются макроэлементами, или зольными элементами. На их долю приходится до 5 10% сухой массы клеток. Железо, марганец, молибден, кобальт, медь, ванадий, цинк, никель и некоторые другие катионы тяжелых металлов называются микроэлементами и составляют доли процента сухой массы клеток. Наибольшее значение для любого живого организма имеет углерод. Он входит в состав всех органических молекул в клетке и на его долю приходится около 50% сухой биомассы. По отношению к углероду все организмы делятся на автотрофные и гетеротрофные. Автотрофы в качестве источника углерода используют углекислый газ. Гетеротрофы нуждаются в готовых органических соединениях. Источником углерода для большей части микроорганизмов могут служить различные органические вещества: белки и продукты их распада, углеводы, жиры, углеводороды. Азотное питание по своему значению стоит на втором месте после углеродного. Азот входит в состав аминокислот и других клеточных компонентов, которые обеспечивают жизнеспособность организмов. Азот составляет 14% от сухого вещества клеток. Источником азота служат азотсодержащие органические или минеральные соединения. Источниками минерального азота чаще всего являются соли аммония и нитраты. В качестве органических источников азота используются белки, аминокислоты, нуклеотиды. Некоторые прокариоты могут использовать атмосферный азот. 35

36 Фосфор и сера входят в состав важных биополимеров клетки. Фосфор (3% сухого вещества клеток) входит в состав нуклеотидов и АТФ, а сера (менее 1%) в состав некоторых аминокислот. В качестве источника фосфора обычно используют фосфаты, а серы сульфаты. Фосфор и сера могут также использоваться в виде органических соединений. Для роста микроорганизмов требуются в небольших количествах макроэлементы: ионы щелочных металлов (Na +, K +) и щелочноземельных металлов (Mg 2+, Ca 2+), которые играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Макроэлементы в клетках микробов необходимы для регулирования проницаемости, осмотического давления, величины рн. Помимо этих металлов, для роста микробов необходим ряд элементов в следовых количествах (микроэлементы). Минеральный состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клетки. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность. Одна из основных функций микроэлементов участие в ферментативном катализе. В настоящее время действие четвертой части всех ферментов в клетке связывают с металлами. Кроме основных компонентов питательной среды для нормального развития некоторых микробов необходимы еще добавочные вещества, которые носят название «факторов роста». Факторы роста это объединенное название различных по химической природе соединений. Главным образом это органические вещества, добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микроорганизмов. Они имеют для микробов то же значение, что витамины для высших организмов. Ростовыми факторами в основном являются витамины группы В, которые играют роль регуляторов и стимуляторов обмена веществ у микробов, или аминокислоты. В качестве факторов роста используют дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, нативные белки (кровь, сыворотка) и др. Потребности в источниках питания микроорганизмов весьма разнообразны. По этой причине не существует универсальной 36

37 среды, одинаково пригодной для культивирования любого микроорганизма. В зависимости от целей культивирования и потребностей данного микроорганизма питательные среды различаются по трем признакам: по составу, физическому состоянию и назначению. По составу питательные среды подразделяются на две группы: 1) естественные (натуральные); 2) искусственные (синтетические). Естественными называются среды, имеющие неопределенный химический состав, так как в них входят продукты растительного или животного происхождения, отходы различных производств, содержащие органические соединения. Естественные питательные среды обеспечивают интенсивный рост самых разнообразных микроорганизмов. Они содержат богатый набор органических и неорганических соединений, в том числе все необходимые элементы и дополнительные вещества. Например, в лабораторных условиях чаще всего используются следующие питательные среды. 1. Мясо-пептонный бульон (МПБ) экстракт из мяса, содержит продукты неполного распада белка пептоны, в которых имеется органический углерод, органический азот, фосфорсодержащие, серосодержащие органические вещества. В МПБ содержатся также все необходимые микроорганизмам минеральные вещества. МПБ применяется при выращивании многих видов бактерий. 2. Пивное сусло экстракт из проросших зерен ячменя, содержит в качестве источника углерода сахара (в основном мальтозу), азотистые вещества, зольные элементы, различные ростовые факторы и витамины группы В. Пивное сусло является хорошей средой для развития многих микроорганизмов, в частности дрожжей, плесневых грибов. Хорошими естественными средами являются молоко, картофель, отвары из плодов и овощей. В промышленности обычно применяют полусинтетические или естественные среды. Очень часто в качестве источника углерода используют отходы микробиологической или пищевой промышленности: меласса (отход сахарного производства), 37

Министерство сельского хозяйства Российской федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ КАМЧАТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА БИОЛОГИИ И ХИМИИ ХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ ВОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЕ

Фамилия Шифр Имя Рабочее место Район Шифр Итого: Задания практического тура регионального этапа XXXII Всероссийской. БИОХИМИЯ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКСТРАКТОВ Оборудование: Пробирки (3 пробирки с экстрактами

Фамилия Шифр Имя Район/город Рабочее место Шифр Итого: ЗАДАНИЯ практического тура регионального этапа XXVIII Всероссийской олимпиады школьников по биологии. 2011-12 уч. год. 11 класс БИОХИМИЯ. Оборудование,

МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА К РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЕ КУРСА «Микробиология», 9 класс» на основе авторской программы элективного курса «Микробиология» Аверчинковой О.Е Биология. Элективные курсы. Лечебное

ЗАДАНИЯ МИКРОБИОЛОГИЯ (мах. 20 баллов) Цель работы: Приготовить и проанализировать препараты из двух известных кисломолочных продуктов. Оборудование: Микроскопы, горелки или спиртовки, предметные стекла,

ЦАРСТВО ПРОКАРИОТЫ ПОДЦАРСТВО БАКТЕРИИ Бактерии относятся к прокариотам. Это самые простые, наиболее мелкие и широко распространенные организмы, которые существуют на земле более 2 млрд. лет, но вместе

СИСтЕМа ОРГаНИчЕСКОГО МИРа Все существующие на Земле организмы разделены на четыре царства: Дробянки, Грибы, Растения, Животные. Дробянки относятся к прокариотам (доядерным организмам), грибы, растения,

Тема проекта Исследование микроорганизмов, обитающих в стоячем водоеме Бутовского леса города Москвы Автор(ы): Касаева Диана, Касаева Кристина, Ткаченко Алиса Школа: ГБОУ СОШ 1945 Класс: 5 класс Руководитель:

Лабораторная работа «Строение тел шляпочных грибов» Цель: изучить строение тел шляпочных грибов Оборудование: шляпочные грибы (белый гриб, сыроежка, шампиньон, подберезовик, масленок, опенок и др.), готовые

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ П.А.СТОЛЫПИНА» ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Утверждаю Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации - Главный врач Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н.БЕЛЯЕВ 20 февраля 2004 г. N 24ФЦ/900 Дата

Исследовательская работа Дрожжи: захватывающая жизнь маленьких грибов Автор работы: учащийся 5 «Б» класса ГБОУ Гимназия 1748 «Вертикаль» Кутайцев Георгий Валерьевич Руководитель: Носова Елена Владимировна,

Метод выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Методы выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах.: Методические рекомендации.- М.: Федеральный центр

Тема 4. Бактерии. Грибы. Лишайники. Часть А. 1. Наличие в составе лишайника цианобактерий обеспечивает 1) поглощение атмосферной и почвенной влаги 2) использование света для образования питательных веществ

БИОЛОГИЯ НАУКА О ЖИВой ПРИРОДе Биология изучает: ЧТО ИЗУЧАЕТ БИОЛОГИЯ z строение и жизнедеятельность живых организмов; z законы индивидуального и исторического развития организмов. 3 СИСТЕМА ОРГАНИЧЕСКОГО

1. Нитрифицирующие бактерии относят к 1) хемотрофам 2) фототрофам 3) сапротрофам 4) гетеротрофам ТЕМА «Фотосинтез» 2. Энергия солнечного света преобразуется в химическую энергию в клетках 1) фототрофов

МИКРОБИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА Задание 1. Приготовить и проанализировать препараты из двух известных кисломолочных продуктов. (мах.10 баллов) Оборудование: Микроскопы, горелки или спиртовки, предметные стекла,

Квалификационные тесты по специальности «Бактериология» Банк тестовых заданий для подготовки к аттестации Выбрать один или несколько правильных ответов 1. В соответствии с приказом ГКСЭН РФ N обязательная

Задания 3. Одноклеточные и многоклеточные организмы. Царство грибы 1. Что содержится в чёрных шариках на концах длинных ответвлений у гриба мукора? 1) микроскопические плоды 2) питательные вещества 3)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся

Морфология микроорганизмов Вариант 1 1. Gracilicutes - это: А. тонкостеночные бактерии Б. толстостеночные бактерии В. бактерии с дефктной клеточной стенкой. Г. бактерии с нежной клеточной стенкой. 2. К

Задание для студентов: необходимо выбрать правильные ответы (может быть от одного до нескольких). Морфология микроорганизмов Вариант 1 1. Gracilicutes - это: А. тонкостеночные бактерии Б. толстостеночные

Водоросли Водоросли низшие растения Водоросли обширная и неоднородная группа низших растений. Водоросли самые многочисленные и одни из самых важных для планеты фотосинтезирующих организмов. Они встречаются

Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Аларская средняя общеобразовательная школа «Рассмотрено» Руководитель МО Протокол от 0 г. «Согласовано» Заместитель директора по УВР МБОУ 0 г «Утверждаю»

1 Основные приемы работы с микроорганизмами Задача 1. Введение в микробиологию.техника безопасности при работе с микроорганизмами Цель задачи. Эта задача познакомит вас с правилами безопасной работы в

Задания 2. Клеточное строение организмов 1. Какой химический элемент входит в состав жизненно важных органических соединений клетки? 1) фтор 2) углерод 3) медь 4) калий 2. В качестве запасающего вещества

Плесневые грибы влияние физических факторов на рост и развитие грибов. Логунов Степан 7г Руководитель проекта Булычева М.Б. Актуальность исследования Споры грибов отличаются высокой устойчивостью к неблагоприятным

Тест 5 Вариант 1. Тема «Грибы» Задания с выбором одного верного ответа. 1. Главное отличие грибов от растений состоит в том, что они: имеют клеточное строение, поглощают из почвы воду и минеральные соли,

1. Пояснительная записка Программа предназначена для поступающих в аспирантуру ФГБОУ ВПО БГУ по специальности 03.02.03 - Микробиология Программа подготовки высококвалифицированных специалистов по направлению

Методические рекомендации

по выполнению практических работ

для профессии:

19.01.17 Повар. Кондитер

Разработчик:

Веретенникова О.М. преподаватель

Валуйки, 2016

Пояснительная записка

Настоящие методические указания для выполнения практических работ по дисциплине « основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевом производстве » были разработаны на основе Федерального государственного образовательного стандарта (далее – ФГОС) по профессии:

19.01.17 Повар. Кондитер

Методические указания для выполнения практических работ предназначены для студентов первого курса Выполнение практических и лабораторных работ направлено на решение следующих задач:

повысить осознание и прочность усвоения знаний;

развивать умения анализировать, сравнивать изучаемые объекты, проводить исследование, составлять таблицы, схемы, кластеры, делать выводы;

развивать у обучающихся логическое мышление, познавательные способности, самостоятельность;

научить использовать полученные знания и умения в жизни.

При изучении, закреплении материала используются следующие типы самостоятельных работ:

Работа с текстом учебника.

Работа с презентацией.

Работа с изучаемым объектом.

Работа с таблицей.

Работа по составлению кластера, схемы.

Работа с готовыми микропрепаратами. Приготовление микропрепаратов.

Структура методических указаний:

1. тема
2. цель работы
3. оборудование для выполнения работ
4. ход работы
5. контроль и актуализация знаний студентов, необходимых для выполнения работы
6. условия выполнения работы

Каждое практическая и лабораторная работа должна быть оформлена в тетради для практических работ в соответствии с рекомендациями . (Приложение 1)

Контроль результатов выполненных работ осуществляется на основании письменного отчета и результатов наблюдения за обучающимся в ходе выполнения работы в соответствии с критериями оценок за выполнение практической работы.

Перечень практических работ

Практическая работа №1

Устройство микроскопа и правила работы с ним.

Практическая работа №2 Изучение под микроскопом морфологии дрожжей и плесени

Практическая работа № 3 Схемы строения клеток бактерий, дрожжей, грибов.

Практическая работа № 4-5

Практическая работа № 6 Схемы приготовления дезинфицирующих растворов и их хранение

Практические задание, направленные на проверку умений обучающихся применять теоретические знания по дисциплине на практике

Практическая работа №1 УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА И ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ.

Цель работы: Изучить устройство светового биологического микроскопа и освоить правила работы с ним.

Оборудование, материалы: Микроскоп; готовые микропрепараты

Микроскоп (от греч. micros – малый и scopio – смотрю) – это оптический прибор, состоящий из трех основных частей: механической, оптической и осветительной.

Схема светового биологического микроскопа представлена на рис. 1.

Механическая часть или штатив состоит из ножки, основания, тубусодержателя, предметного столика, монокулярной насадки (тубуса), револьверного устройства, рукоятки грубой фокусировки (макрометрического винта), рукоятки тонкой фокусировки (микрометрического винта).

Тубус – зрительная труба микроскопа. В верхнее отверстие тубуса свободно вставляется окуляр, на нижнем конце тубуса находится вращающееся вокруг своей оси револьверное устройство (револьвер), в которое ввинчиваются объективы. Вращая револьвер, можно быстро сменить объективы во время работы с микроскопом, подводя любой объектив под тубус. Объектив должен быть центрирован, т.е. установлен на оптическую ось микроскопа. Для этого револьвер поворачивают вокруг своей оси до появления щелчка.

Предметный столик служит для размещения на нем изучаемого препарата. Препарат закрепляют на столике зажимами (клеммами). В центре предметного столика находится отверстие для прохождения лучей света и освещения препарата. В некоторых конструкциях микроскопа предметный столик может передвигаться с помощью винтов, расположенных по периферии предметного столика. Это дает возможность рассмотреть препарат в различных полях зрения.

1 – окуляр

2 – монокулярная насадка

(тубус)

3 – револьверное устройство

4 - объектив

5 – предметный столик

6 - конденсор

7 – корпус коллекторной линзы

8 – патрон с лампой

9 - шарнир

10 – рукоятка перемещения кронштейна конденсора

11 – рукоятка тонкой фокусировки (микрометрический винт)

12 – рукоятка грубой фокусировки (макрометрический винт)

13 - тубусодержатель

14 – винт для крепления насадки

Рис. 1 Схема устройства светового биологического микроскопа

Рукоятки грубой и тонкой фокусировки (макро- и микровинты) служат для перемещения тубуса вверх и вниз, что позволяет установить его на необходимом расстоянии от препарата. При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается, а при вращении против часовой стрелки – поднимается. При вращении макрометрического винта объектив ориентировочно устанавливается на фокус, т.е. на то расстояние от препарата, при котором он делается видимым. Оборот макровинта позволяет переместить тубус на 20 мм. Микрометрический винт служит для точной установки на фокус. Полный оборот его перемещает тубус на 0,1 мм. С микровинтом следует обращаться очень осторожно: допустимо вращение микровинта не более чем на 180 0 С в ту или иную сторону.

Оптическая часть является наиболее ценной частью микроскопа. Она состоит из объективов и окуляра.

Окуляр (от лат. oculus – глаз) состоит их двух плосковыпуклых линз, заключенных в общую металлическую оправу. Верхняя линза – глазная (увеличивающая), нижняя – собирающая. Расстояние между линзами равно полусумме их фокусного расстояния. У окуляров с большим увеличением фокус короче, поэтому меньше и длина окуляра. Между линзами имеется диафрагма, ограничивающая поле зрения и задерживающая краевые лучи света. Отечественные микроскопы снабжены тремя сменными окулярами, увеличение которых указано на корпусе окуляра (х7; х10; х15).

Объективы ввинчиваются в гнезда револьверного устройства и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя (фронтальная) линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе только исправляют недостатки полученного изображения (явления сферической и хроматической аберрации) и называются коррекционными.

В гнезда револьверного устройства ввинчиваются четыре объектива, увеличение которых указано на корпусе объектива (х8; х20; х40; х90 или 100). Каждый объектив характеризуется своим фокусным расстоянием (расстоянием между предметным стеклом и фронтальной линзой): объектив х8 имеет фокусное расстояние около 9 мм, объектив х40 – 0,65 мм, объектив х90 – 0,15 мм.

Осветительная часть микроскопа состоит из двухлинзового конденсора, ирис-диафрагмы и патрона с низковольтной лампочкой накаливания, питающейся через понижающий трансформатор от сети напряжения 120…220 В.

Конденсор служит для лучшего освещения препарата. Он собирает световые лучи в пучок и направляет их через отверстие предметного столика на препарат. С помощью рукоятки для перемещения кронштейна конденсора его можно перемещать вверх и вниз, благодаря чему меняется угол сходимости лучей и, следовательно, степень освещения объекта. Чем выше положение конденсора, тем лучше освещен препарат.

Ирис-диафрагма располагается под конденсором и служит для регулировки потока света, поступающего в конденсор. Она состоит из металлических серповидных пластинок. Расширить или сузить отверстие диафрагмы можно с помощью специального рычажка. При вращении его по часовой стрелке отверстие ирис-диафрагмы увеличивается и, следовательно, увеличивается степень освещения объекта.

При работе с иммерсионными объективами степень освещения препарата должна быть максимальной, поэтому шторку ирис-диафрагмы открывают, а конденсор поднимают в крайнее верхнее положение.

При работе с сухими объективами, как правило, рассматривают неокрашенные объекты. Для достижения контрастности конденсор опускают вниз, а отверстие ирис-диафрагмы уменьшают.

Правила работы с микроскопом

На рабочем столе микроскоп ставят тубусодержателем к себе на расстоянии 3…5 см от края стола;

Включают микроскоп в сеть и устанавливают правильное освещение

На предметный столик помещают исследуемый препарат и закрепляют его клеммами;

Под тубус помещают нужный объектив и с помощью макро и микровинтов устанавливают фокусное расстояние. Так, при работе с иммерсионными объективами на препарат предварительно наносят каплю иммерсионного масла и осторожно опускают тубусодержатель макровинтом до соприкосновения со стеклом. Затем, внимательно смотря в окуляр, очень медленно поднимают тубусодержатель, вращая его против часовой стрелки, до тех пор, пока не увидят изображение. Точную наводку объектива на фокус производят микрометрическим винтом. При работе с сухими объективами препарат вначале рассматривают с объективом х8. Поднимая с помощью макровинта тубусодержатель и внимательно смотря в окуляр, устанавливают фокусное расстояние (около 9 мм) и добиваются четкости изображения, используя микрометрический винт. Далее, двигая предметный столик или предметное стекло, устанавливают в центр поля тот участок препарата, в котором лучше всего виден изучаемый объект. Затем, вращая револьверное устройство вокруг своей оси, под тубус помещают объектив на х20 или х40. При этом под тубус не должен попасть объектив х90. В револьверном устройстве объективы располагаются таким образом, что если найдено изображение с объективом х8, то при рассмотрении препарата с объективами большего увеличения нужно слегка подрегулировать четкость изображения с помощью макро- и микрометрических винтов;

Во время микроскопирования необходимо держать оба глаза открытыми и пользоваться ими попеременно;

После окончания работы следует убрать препарат с предметного столика, опустить вниз конденсор, поставить под тубус объектив х8, удалить мягкой тканью или марлей, смоченной в спирте, иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива х90, под объектив положить марлевую салфетку, опустить тубусодержатель.

Каково устройство биологического микроскопа?

Из каких частей и механизмов состоит механическая часть микроскопа?

Что составляет оптическую систему микроскопа?

Что входит в состав осветительной системы микроскопа?

Как следует настроить осветительную систему при работе с иммерсионным объективом?

Перечислить основные правила работы с микроскопом.

Условия выполнения задания
1. Место (время) выполнения задания
Кабинет биологии

Практическая работа №2 Изучение под микроскопом морфологии дрожжей и плесени.

Цель работы : Ознакомиться с морфологическими особенностями грибов и дрожжей, встречающихся при производстве пищевых продуктов. Освоить технику микроскопического исследования грибов и дрожжей в препаратах «раздавленная капля».

Оборудование, материалы: Микроскоп; препаровальные иглы,предметные и покровные стекла; фильтровальная бумага; спиртовка; культуры грибов родов Mucor , Aspergillus , Penicillium , Alternaria ; чистая культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae .

1. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. 1. Морфология и культуральные признаки микроскопических грибов

Вегетативное тело грибов называется мицелием . Мицелий состоит из множества переплетающихся нитей-трубочек, называемых гифами . Диаметр гифов, колеблется от 5 до 50 мкм. В зависимости от строения мицелия грибы делятся на высшие и низшие. У высших грибов гифы разделены перегородками (септами) в центре которых имеется большая пора. Они растут и при этом происходят деления ядер, но не происходит клеточных делений. Таким образом, вегетативное тело гриба представляет собой одну большую многоядерную клетку. Все микроскопические грибы могут размножаться вегетативно кусочком мицелия.

При бесполом размножении у фикомицетов образуются спорангиеносцы , а у аскомицетов – конидиеносцы .

Культуральные признаки микроскопических грибов

Колонии микроскопических грибов по размерам во много раз превосходят колонии одноклеточных организмов (бактерий, грибов) и нередко разрастаются по всей поверхности питательной среды в чашках Петри. Консистенция грибных колоний различная. Чаще образуются войлокообразные и кожистые колонии, реже крошковатые. Поверхность колоний может быть пушистой, как вата, бархатистой, мучнистой, паутинообразной, нитевидной, кожистой или гладкой. При росте на плотных и жидких средах часть гифов врастает в питательную среду, образуя субстратный мицелий, а другая часть гифов образует воздушный мицелий в виде пушистого налета, видимого невооруженным глазом. Мицелий может быть также бесцветным (белым, сероватым) или окрашенным (черным, бурым, зеленым, желтым и т.д.). Пигментирован только плодоносящий мицелий.

Характеристика микроскопических грибов различных классов

Морфологические особенности грибов различных классов представлены на рис. 5.

Род Mucor . Они могут размножаться бесполым и половым путем с образованием спорангиеносцев (рис. 5). Снаружи спорангий покрыт тонкими шипами из кристаллов щавелевокислого кальция. При созревании спорангий разрывается, спорангиеспоры высвобождаются и разносятся воздушными потоками. На спорангиеносце после освобождения спорангия от спор остается колонка, а в нижней ее части – воротник. Цвет мицелия мукоровых грибов вначале белый, затем серовато-оливковый, вид – войлокоподобный .

а

б

в

г

Рис. 5 Морфологические особенности грибов различных классов:

а - Mucor; б - Penicillium; в - Aspergillus; г - Alternaria

Мукоровые грибы растут на поверхности влажного зерна, солода, корнеплодов, на пищевых продуктах, на стенах сырых помещений в виде сероватого пушистого налета. Mucor nigricans является возбудителем кагатной гнили сахарной свеклы. Многие мукоровые грибы используются в промышленности для производства различных органических кислот и спирта (грибы видов Mucor javanicus , Mucor racemosus ), ферментных препаратов, каротиноидов, стероидов.

Представители родов Aspergillus и Penicillium относятся к классу аскомицетов, который объединяет высшие микроскопические совершенные грибы. При бесполом размножении с помощью спор эти грибы образуют конидиеносцы (рис. 5). Аспергиллы и пенициллы относятся к плодосумчатым грибам. Это значит что при половом размножении у них на специальных плодовых телах образуются аски (сумки), в которых находятся 8 аскоспор.

К роду Penicillium относится около половины всех плесневых грибов. Они широко распространены в почве, в воздухе плохо проветриваемых помещений и вызывают порчу различных продуктов и материалов. Этот гриб имеет ветвящийся септированный мицелий (диаметр гифов – 2…3 мкм) и септированные конидиеносцы (напоминают кисточки), которые на конце разветвляются в виде отростков – стеригм. От них отходят конидии, состоящие из цепочек спор. В зависимости от вида конидии могут быть разного цвета (белые, зеленые и др.). Многие пенициллы используются в промышленности для получения различных ценных продуктов. Среди выделенных штаммов этого рода 25 % обладают антибиотической активностью, а такие виды как Penicillium notatum , Penicillium chrysogenum используются как продуценты пенициллина. Некоторые виды пенициллов используются как продуценты ферментов и липидов. В производстве мягких сыров рокфор и камамбер используются благородные плесени Penicillium roqueforti и Penicillium camamberti .

Грибы рода Aspergillus насчитывают более 200 видов. Эти грибы имеют хорошо развитый ветвящийся мицелий с многочисленными септами. Конидиеносцы несептированы, верхние их концы грушевидно или шаровидно расширены в виде небольшой головки. На головке располагаются кеглеобразные стеригмы с цепочками конидий, которые напоминают струйки воды, выливающиеся из лейки. Отсюда возникло название «леечная плесень» (aspergere по латыни – поливать, опрыскивать). Конидии аспергиллов при созревании приобретают различную окраску, что наряду с другими признаками определяет их видовую принадлежность.

Так же как и пенициллы, представители рода Aspergillus широко распространены в природе и играют важную роль в минерализации органических веществ. Они вызывают плесневение многих пищевых продуктов. Эти грибы являются продуцентами многих ценных веществ и широко используются в промышленности. Так, Aspergillus niger , применяют в промышленности для производства лимонной кислоты; Aspergillus terreus – итаконовой кислоты Aspergillus flavus и Aspergillus terricola образуют наиболее активный комплекс протеолитических ферментов; Aspergillus oryzae и Aspergillus awamori являются лучшими продуцентами амилолитических ферментов.

Грибы рода Alternaria относятся к классу несовершенных грибов – дейтеромицетов. Это высшие грибы. Они имеют септированный мицелий и короткие несептированные конидиеносцы, на которых находятся многоклеточные конидии грушевидной или лимоновидной формы (рис. 5). Гриб является возбудителем черной гнили – болезни корнеплодов и плодов, а также возбудителем порчи пищевых продуктов.

Морфология дрожжей и их характеристика

Дрожжи – это высшие одноклеточные грибы. Большинство дрожжей относится к двум классам грибов – аскомицетам и дейтеромицетам.

Дрожжи по отношению к кислороду делятся на факультативные анаэробы (в аэробных условиях осуществляют дыхание и активно накапливают биомассу, а в анаэробных условиях вызывают спиртовое брожение) и аэробы.

Морфологически дрожжи разнообразны. Они отличаются друг от друга размерами и формой клеток. Размеры клеток дрожжей в зависимости от вида варьируют в следующих пределах; от 2,5 до 10 мкм в поперечнике и от 4 до 20 мкм в длину. Морфологическое разнообразие форм дрожжей изображено на рис. 6.

а

б

в

г

д

е

ж

з

Рис. 6 Формы дрожжевых клеток: а - овальная яйцевидная;

б - цилиндрическая; в – апикулятная; лимоновидная; г – стреловидная;

д – треугольная; е – серповидная; ж – колбовидная; з, и - мицелевидная

Форма и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования.

В зависимости от вида дрожжи вегетативно могут размножаться почкованием (так размножаются дрожжи овальной формы), бинарным делением (характерно для дрожжей цилиндрической или палочковидной формы) или почкующимся делением. Кроме вегетативного размножения, дрожжи – аскомицеты могут размножаться половым путем с образованием аскоспор.

Из дрожжей, относящихся к классу аскомицетов, большое значение имеют дрожжи-сахаромицеты рода Saccharomyces , которые широко используются в пищевой промышленности. Главным биохимическим признаком этих дрожжей является то, что они сбраживают сахара с образованием этилового спирта и диоксида углерода. Дрожжи, используемые в промышленности, называются культурными дрожжами. Так, в хлебопекарном производстве и в производстве спирта используются верховые дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae . Дрожжи вида Saccharomyces minor нашли применение в производстве ржаного хлеба и кваса. В пивоварении используются низовые дрожжи Saccharomyces carlsbergensis . Дрожжи-сахаромицеты имеют овальную форму, вегетативно размножаются почкованием, в неблагоприятных условиях размножаются половым путем аскоспорами.

Некоторые спорогенные дрожжи являются дикими дрожжами . Эти дрожжи так же, как и культурные, способны осуществлять спиртовое брожение, но помимо спирта образуют много побочных продуктов (таких как альдегиды, высшие спирты, эфиры и др.) и поэтому ухудшают органолептические показатели продукта. Эти дрожжи являются вредителями производства различных напитков (пива, вина, безалкогольных напитков), а также возбудителями порчи многих пищевых продуктов.

Дрожжи - дейтеромицеты могут размножаться только вегетативным способом. Некоторые из этих дрожжей (например, дрожжи рода Candida ) используются в промышленности для получения кормового белка, органических кислот, витаминов и других продуктов микробного синтеза. Дрожжи вида Torulopsis kefir входят в состав симбиотической закваски – кефирного грибка. Другие представители несовершенных (аспорогенных) дрожжей являются дикими дрожжами и вызывают порчу многих пищевых продуктов. К дрожжам- вредителям производства относятся дрожжи родов Pichia , Hansenula , Candida , Rhodotorula, Torula , Torulopsis , Mycoderma , Trichosporon и др. Среди аспорогенных дрожжей встречаются ложные дрожжи , которые образуют псевдомицелий и растут на жидких субстратах в виде пленок.

1. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

На предметное стекло трубочкой или пипеткой наносят большую каплю воды;

Отбирают небольшое количество мицелия из пробирки или чашки Петри, соблюдая правила асептики

Мицелий аккуратно помещают в каплю, нанесенную на предметное стекло и с помощью двух игл расправляют его в воде;

Препарат накрывают покровным стеклом и слегка придавливают. Излишки воды удаляют с помощью фильтровальной бумаги.

Микроскопируют препарат «раздавленная капля» сначала с объективом х8, а затем х40 в затемненном поле зрения (конденсор опущен, шторка ирис-диафрагмы прикрыта).

При отборе и микроскопии препаратов грибов учитывают следующие рекомендации:

а) гриб рода Mucor . Отбирают черновато-серый пушистый воздушный мицелий. При микроскопии обращают внимание на гифы с заполненными спорами спорангиями и колонки, которые образуются при освобождении спорангия;

б) гриб рода Aspergillus . Отбирают немного пушистого мицелия с окрашенными конидиями, слегка углубляясь иглой в питательную среду. Обращают внимание на несептированные конидиеносцы;

в) гриб рода Penicillium . При отборе стараются взять молодой мицелий (на границе окрашенного и белого мицелия), углубляясь иглой в среду. Обращают внимание на септированные гифы с кисточками.

г) гриб рода Alternaria . Берут грибницу в черных участках, углубляясь в нее иглами. Обращают внимание на септированный мицелий, слабо развитые конидиеносцы и крупные конидии, имеющие вид округлых или заостренных многоклеточных образований, напоминающих «гранаты-лимонки».

При исследовании дрожжей на предметное стекло наносят суспензию дрожжей, накрывают покровным стеклом, излишки воды удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопируют препарат и объективом х8 и х40.

Оформление и анализ результатов исследований

Кратко конспектируют теоретический материал. Зарисовывают микроскопические картины исследованных культур грибов и дрожжей с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма. Под каждым рисунком подписывают латинское название и увеличение препарата. Описывают культуральные свойства изучаемых грибов.

Ответить на контрольные вопросы

Как готовятся препараты микроскопических грибов и дрожжей?

Охарактеризуйте морфологические и культуральные свойства микроскопических грибов.

Какие грибы используются в промышленности для получения органических кислот, ферментов, антиб0иотиков и других ценных продуктов?

Охарактеризуйте морфологические свойства дрожжей.

Что такое культурные дрожжи? В каких отраслях пищевой промышленности они используются?

Условия выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Практическая работа №3: Схемы строения клеток бактерий, дрожжей, грибов.

Цель работы: Изучить строение клетки бактерий, дрожжей, грибов

Материальное обеспечение: инструктивные карты для выполнения практической работы, учебник, карандаши

Задание 1

Изучит материал учебника. По результатам изучения:

Зарисуйте в тетрадь строение клетки бактерий, дрожжей и грибов и укажите отличительные признаки

Письменно ответить на вопросы:

1. Какую форму имеют клетки бактерий?

2. Каковы размеры бактерий?

3.Каким образом происходит размножение бактерий, скорость размножения?

4.Каким образом, и в каких условиях происходит образование спор у бактерий?

5.Способны ли бактерии к самостоятельному движению?

Сделайте вывод по результатам работы.

Условия выполнения задания

1. Место (время) выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Практическая работа по теме №4 Работа с нормативно-технической документацией: СанПиН 2.3.6. 1079-01

Цель работы: Изучить санитарные требования к устройству и содержанию предприятий общественного питания

Материальное обеспечение: инструктивные карты для выполнения практической работы, СанПиН 2.3.6. 1079-01

Задание 1

Изучит материал учебника. СанПиН 2.3.6. 1079-01. По результатам изучения:

1. Допишите фразы: Участок, где построено предприятие общественного питания, должен быть

К производственным помещениям относятся:

Складские помещения проектируются в ____________________ части здания.

Питьевая вода по качеству должна соответствовать

Для очистки воздуха используется вентиляция

Типа.

Все производственные помещения должны освещаться

Светом.

Ежемесячная уборка помещений называется

2. Дайте определение следующим понятиям:

Дезинфекция это –

Дератизация это –

Дезинсекция это –

3. Используя учебный материал, заполните таблицу:

Овощной цех

Мясной цех

Рыбный цех

Горячий цех

Холодный цех

Кондитерский цех

Раздаточная

Условия выполнения задания

1. Место (время) выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Практическая работа № 5 Работа с нормативно-технической документацией: СанПиН 2.3.6. 1079-01

Цель работы : Изучить санитарные требования к оборудованию, инвентарю, посуде, таре. Транспортировке и хранению пищевых продуктов.

Материальное обеспечение : инструктивные карты для выполнения практической работы, СанПиН 2.3.6. 1079-01

Задание 1

Изучит материал учебника, СанПиН 2.3.6. 1079-01. По результатам изучения:

1. Письменно ответьте на вопросы:

Что относится к кухонной посуде?

Для чего маркируют посуду?

Что относится к столовой посуде?

Какие материалы допускаются для производства оборудования и инвентаря

для предприятий общественного питания?

В чем состоит принципиальная разница при мытье столовой посуды и столовых приборов?

2. Перечислите правила и требования:

2.1. Санитарные правила перевозки полуфабрикатов:

2.2. Санитарные правила хранения пищевых продуктов:

3. Допишите фразы:

До начала раздачи качество готовых блюд должно

При подаче первые блюда и горячие напитки должны иметь температуру

_______ °С, вторые блюда и гарниры температуру ______ °С, порционные блюда

температуру ______ °С, холодные блюда и напитки ______ °С.

В лечебно-профилактических и детских учреждениях в зимне-весенний период из-за недостатка в овощных блюдах ___________________ требуется обогащать этим некоторые блюда.

За качество готовой продукции и соблюдение правил её отпуска на предприятиях общественного питания несут ответственность ________________

Условия выполнения задания

1. Место (время) выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Практическая работа № 6 Схемы приготовления дезинфицирующих растворов и их хранение

Цель: изучить наименование дезинфицирующих средств, способы приготовления дезинфицирующих растворов в зависимости от назначения. Приготовить раствор заданной концентрации.

Материальное обеспечение : инструктивные карты для выполнения практической работы, СанПиН 2.3.6. 1079-01, учебник

Задание 1

Изучит материал учебной литературы, СанПиН 2.3.6. 1079-01. По результатам изучения:

1. Ответить на вопросы:

Какие растворы относятся к дезинфицирующим?

С какой целью применяют дезинфицирующие растворы?

Какие препараты используют как дезинфекторы?

Как распознать что посуду обрабатывали дезинфекторами?

2. Изучить схемы приготовления и назначение дезинфицирующих средств. Заполнить таблицу.

3. Приготовить 1литр 0,2 % раствора хлорамина Б.

4. Сделать вывод по результатам работы.

Условия выполнения задания

1. Место (время) выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Критерии оценок за выполнение практической работы:
Оценка «5» ставится, если :
1. Правильной самостоятельно определяет цель данных работ; выполняет работу в полном объёме с соблюдением необходимой последовательности проведения.
2. Самостоятельно, рационально выбирает и готовит для выполнения работ необходимое оборудование; проводит данные работы в условиях, обеспечивающих получение наиболее точных результатов.
3. Грамотно, логично описывает ход работ, правильно формулирует выводы; точно и аккуратно выполняет все записи, таблицы, рисунки, чертежи, графики, вычисления.
4. Проявляет организационно-трудовые умения: поддерживает чистоту рабочего места, порядок на столе, экономно расходует материалы; соблюдает правила техники безопасности при выполнении работ.
Оценка «4» ставится, если :
1. Выполняет лабораторную работу полностью в соответствии с требованиями при оценивании результатов на "5", но допускает в вычислениях, измерениях два - три недочёта или одну негрубую ошибку и один недочёт.
2. При оформлении работ допускает неточности в описании хода действий; делает неполные выводы при обобщении.
Оценка «3» ставится, если :
1.1 Правильно выполняет работу не менее, чем на 50%, однако объём выполненной части таков, что позволяет получить верные результаты и сделать выводы по основным, принципиальным важным задачам работы.
2. Подбирает оборудование, материал, начинает работу с помощью преподавателя; или в ходе проведения измерений, вычислений, наблюдений допускает ошибки, неточно формулирует выводы, обобщения.
3. Проводит работу в нерациональных условиях, что приводит к получению результатов с большими погрешностями; или в отчёте допускает в общей сложности не более двух ошибок (в записях чисел, результатов измерений, вычислений, составлении графиков, таблиц, схем и т.д.), не имеющих для данной работы принципиального значения, но повлиявших на результат выполнения.
4. Допускает грубую ошибку в ходе выполнения работы: в объяснении, в оформлении, в соблюдении правил техники безопасности, которую ученик исправляет по требованию учителя.
Оценка "2" ставится, если :
1. Не определяет самостоятельно цель работы, не может без помощи преподавателя подготовить соответствующее оборудование; выполняет работу не полностью, и объём выполненной части не позволяет сделать правильные выводы.
2. Допускает две и более грубые ошибки в ходе работ, которые не может исправить по требованию педагога; или производит измерения, вычисления, наблюдения неверно.

ПРИЛОЖЕНИЕ.

Приложение 1

ПАМЯТКА СТУДЕНТУ

При выполнении работы студент обязан:

Предварительно подробно ознакомиться с теоретическим материалом и хорошо понять микробиологические закономерности и процессы, которые предстоит изучить на практике.

Выполняя эксперимент, соблюдать все меры предосторожности, последовательность операций, проводя нужные наблюдения.

Записать результаты опыта в тетради по схеме, предложенной в работе:

После окончания работы привести в порядок рабочее место и сдать его лаборанту или преподавателю.