С помощью световой микроскопии в клетке. Методы световой микроскопии. Проведение темнопольного исследования

К концу XIX в. большая часть структур, которые удается разглядеть с помощью светового микроскопа (т. е. микроскопа, в котором для освещения объекта используется видимый свет) была уже открыта. Клетка представлялась тогда чем-то вроде маленького комочка живой протоплазмы, всегда окруженного плазматической мембраной, а иногда - как, например, у растений и неживой клеточной стенкой. Самой заметной структурой в клетке было ядро, содержащее легко окрашивающийся материал - хроматин (слово это в переводе и означает - «окрашенный материал»).

Хроматин представляет собой деспирализованную форму хромосом . Перед клеточным делением хромосомы имеют вид длинных тонких нитей. В хромосомах находится ДНК - генетический материал. ДНК регулирует жизнедеятельность клетки и обладает способностью к репликации, т. е. обеспечивает образование новых клеток .

На рисунках представлены обобщенные животная и растительная клетки , какими они видны в световом микроскопе.(В «обобщенной» клетке показаны все типичные структуры, обнаруживаемые в любой клетке.)

Единственные структуры клетки , которые показаны здесь и которые к концу XIX в. еще не были открыты - это лизосомы. На рисунках представлены микрофотографии некоторых животных и растительных клеток.

Живое содержимое клетки , заполняющее пространство между ее ядром и плазматической мембраной, называется цитоплазмой. В цитоплазме содержится множество различных органелл. Органелла - это клеточная структура определенного строения, выполняющая определенную функцию. Единственная структура, имеющаяся в животных клетках и отсутствующая в растительных - это центриоль. Вообще же растительные клетки очень похожи на животные, но в них обнаруживается больше различных структур. В отличие от животных клеток в растительных клетках имеются:

1) относительно жесткая клеточная стенка , покрывающая снаружи плазматическую мембрану; сквозь поры в клеточной стенке проходят тонкие нити, так называемые плазмодесмы, которые связывают цитоплазму соседних клеток в единое целое;
2) хлоропласта , в которых протекает фотосинтез;
3) крупная центральная вакуоль ; в животных клетках имеются лишь небольшие вакуоли, с помощью которых осуществляется, например, .

О том, как пользоваться световым микроскопом читатель узнает в соответствующей статье.

Прокариоты и эукариоты

В предыдущей статье мы уже говорили о двух типах клеток - прокариоти ческих и эукариоти ческих, - различия между которыми носят фундаментальный характер. В прокариотических клетках ДНК свободно лежит в цитоплазме, в зоне, называемой нуклеоидом; это ненастоящее ядро. У эукариотических клеток ДНК находится в ядре, окруженном ядерной оболочной, состоящей из двух мембран. Соединяясь с белком, ДНК образует хромосомы. О различиях между прокариотическими и эукариотическими клетками более подробно говорится в соответствующей статье.

Световая микроскопия - это самый древний и в тоже время один из распространенных методов исследования и изучения растительной и животной клетки. Предполагается, что начало изучения клетки было именно с изобретением светового оптического микроскопа. Главная характеристика светового микроскопа - это разрешение светового микроскопа, определяемое длиной световой волны. Предел разрешения светового микроскопа определяется длиной световой волны, оптический микроскоп используется для изучения структур, которые имеют минимальные размеры равные длине волны светового излучения. Многие составляющие клетки близки по своей оптической плотности и требуют предварительной обработки перед микрокопированием, в противном же случае они практически не видны в обычный световой микроскоп. Для того, чтобы сделать их видимыми, используют различные красители, обладающие определенной избирательностью. Используя избирательные красители, появляется возможность более подробно исследовать внутреннее строение клетки.

Например:

краситель гематоксилин окрашивает некоторые компоненты ядра в синий или фиолетовый цвет;

после обработки последовательно флороглюцином и затем соляной кислотой одревесневшие оболочки клеток становятся вишнево - красными;

краситель судан III окрашивает опробковевшие клеточные оболочки в розовый цвет;

слабый раствор йода в йодистом калии окрашивает крахмальные зерна в синий цвет».

При проведении микроскопических исследований большую часть тканей перед началом окраски фиксируют.

После фиксации клетки становятся проницаемыми для красителей, а структура клетки стабилизируется. Одним из наиболее распространенных фиксаторов в ботанике является этиловый спирт.

В ходе приготовления препарата для микрокопирования выполняют тонкие срезы на микротоме (приложение 1, рис.1). В этом приборе использован принцип хлеборезки. Для растительных тканей изготавливают чуть более толстые срезы, чем для животных, поскольку клетки растений относительно крупней. Толщина срезов растительных тканей для - 10 мкм - 20 мкм. Некоторые ткани слишком мягкие, чтобы из них сразу же можно было получить срезы. Поэтому после фиксации их заливают в расплавленный парафин или специальную смолу, которые пропитывают всю ткань. После охлаждения образуется твердый блок, который потом режется на микротоме. Это объясняется тем, что растительные клетки имеют прочные клеточные стенки, составляющие каркас ткани. Особенно прочны одревесневшие оболочки.

Пользуясь заливкой при приготовлении, срез возникает опасность нарушения структуры клетки, для предотвращения этого пользуются методом быстрого замораживания. При использовании этого метода обходятся обойтись без фиксации и заливки. Замороженную ткань режут на специальном микротоме - криотоме (приложение 1, рис. 2).

Замороженные срезы лучше сохраняют особенности естественной структуры. Однако их труднее готовить, а присутствие кристаллов льда нарушает некоторые детали.

фазово-контрастный (прилож. 1, рис. 3) и интерференционный микроскопы (прилож.1, рис.4) позволяют исследовать под микроскопом живые клетки с четким проявлением детали их строения. В этих микроскопах используют 2 пучка световых волн, которые взаимодействуют (налагаются) друг на друга, усиливая или уменьшая амплитуду волн, поступающих в глаз от разных компонентов клетки.

Световая микроскопия имеет несколько разновидностей.

Методы световой и электронной микроскопии

1. Световая микроскопия

световой электронный микроскоп интерференция

Световой микроскоп может повысить разрешающую способность человеческого глаза примерно в 1000 раз. Это является "полезным" увеличением микроскопа. При использовании видимой части спектра света конченый предел разрешения светового микроскопа составляет 0,2-0,3 мкм. Далее будут рассмотрены методы световой микроскопии.

1 Метод темного поля (ультрамикроскопии)

Метод тёмного поля в проходящем свете основан на эффекте Тиндаля, так как подобна частичкам пыли с луче света, при боковом освещениии светятся мельчайшие частицы, отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат не попадает в объектив. Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип - препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц размером до 210-9 м. Но форму и точные размеры этих частиц с помощью этого метода определить невозможно. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

2 Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них поглощающими свет частицами и деталями. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения, это помогает выявить "рельефность" объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов. Освещение производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

1.3 Метод фазово-контрастной микроскопии

Большая часть клеточных структур мало отличается коэффициентом преломления света, поглощения лучей друг от друга и среды. Для того, чтобы изучить такие компоненты приходится изменять освещенность(с потерей четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Метод фазово-контрастной микроскопии является одним из таких. Его широко применяют при витальном изучении клеток. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Невидимые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. В получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Объекты могут выглядеть темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

4 Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия)

Метод интерференционного контраста сходен с предыдущим - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Пучок параллельных световых лучей от осветителя раздваивается на два потока, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу и приобретает изменения в фазе колебания, другой - мимо минуя объект по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.

5 Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете за объектами, обладающими изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. Перед конденсором поляризационного микроскопа помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Если анализатор повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

6 Витальное изучение клеток

Методы световой микроскопии дают нам возможность наблюдать живые клетки. Для короткого наблюдения клетки обычно помещают в жидкую среду на предметное стекло. Но для более длительного времени нужны другие способы. Часто для длительного наблюдения используют специальные камеры (плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или разборные плоские камеры). Клетки изучают в специально подобранных для них средах. Обычно для простейших это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов и других простейших, служащих для объекта изучения пищей. Свободные клетки многоклеточных могут изучаться в плазме крови или в специальных синтетических средах. Для изучение клеток и тканей животных используют метод клеточных культур.

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) искусственно выращиваются в контролируемых условиях для дальнейшего изучения. Более простой вариант этого метода представляет собой то, что в камеру с питательным раствором помещается небольшой кусочек живой ткани и через некоторое время по периферии начинает идти рост и деление клеток. Второй способ получения культуры клеток это обработка кусочка ткани трипсином или хелатоном (что приведет к диссоциации клеток), а затем помещение в сосуд с питательным экстрактом, где, после опущения клеток на дно и их прикрепления, начинается рост и размножение культуры. Для культуры клеток предпочитают использовать эмбриональный материал, который обладает большей способностью к делению чем взрослый. При культуре клеток следует соблюдать специальные условия стерильности, температурного режима, pH. Таким же методом можно культивировать клетки растительного происхождения. Для этого их обрабатывают ферментами, растворяющими клеточные оболочки, а отделившееся содержимое помещают в специальную среду, где происходит их рост и деление. Вместе с культивированием клеток обычно используют микрокиносъемку и микрофотосъемку, с помощью которой регистрируются многие клеточные процессы.

6.2 Метод микрохирургии

Метод микрохирургии применяется для исследования живых клеток. Это метод оперативного вмешательства и воздействия на клетку, в т.ч. удаление или вживление отдельных органелл. Этот метод также предусматривает пересадку органелл из клетки в клетку, введение крупных макромолекул в клетку. Обычно микроманипулятор совмещается с микроскопом, который служит для наблюдения за ходом оперативного вмешательства. Микрохирургическими инструментами являются стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые изготавливаются на "микрокузницах". При микрооперациях клетку помещают в специальную камеру, куда также вводят инструменты. В последнее время также широко используются лазерные микропучки и микропучки UV спектра. Их применяют для точечного поражения клетки в ходе исследования.

6.3 Метод флуоресцентной микроскопии

Метод получения увеличенного изображения с использованием свечения возбуждённых атомов и молекул образца. В флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой, а изображение получают в оптическом спектре. Изображение флуоресцентного препарата может сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Довольно часто используются вещества способные к флуоресценции или же в клетку инъецируются флуоресцентные агенты

Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия - метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца.

1.6.4 Метод конфокальной сканирующей световой микроскопии

Конфокальный световой сканирующий микроскоп используют для получения трехмерной реконструкции объекта. С его помощью получают серию последовательных срезов клетки, взятой с различной глубины. После этого специальная компьютерная программа сводит эти изображения воедино и мы можем получить объемное, трехмерное изображение объекта.

7 Изучение фиксированных клеток

Многие данные об устройстве и функционировании клетки были получены именно на фиксированных клетках. Фиксация - сложный процесс, направленный на убийство клетки, прекращение активности клеточных ферментов, распада компонентов, избежание потери структур и веществ, а также их приобретения, если они отсутствовали в живой клетке. Но, к сожалению, еще не существует фиксатора, который бы удовлетворял всем этим требованиям.

7.1 Методы цитохимического анализа

Это ряд приемов окрашивания, главной целью которого является выявление специфических химических веществ клетки. Существует целый ряд приемов окрашивания, прямо выявляющие те или иные вещества. К таким цитохимическим реакциям предъявляют требования: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества. Пример такой реакции это реакция на ДНК - Фёльгена.

7.2 Метод цитофотометрии

Данный метод позволяет количественно измерить конечный продукт цитохимической реакции. Он основывается на определении кол-ва веществ по поглощению ими света определенной волны. Интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Для этого метода используют микроскопы-цитофотометры (за их объективами расположен чувствительный фотометр). Этот метод широко используется при определении количества ДНК после реакции Фёльгена. Также можно провести количественную оценку не только поглощающих свет веществ, но и его излучающих. На этом основывается флуорометрия.

7.3 Метод иммунохимического исследования (иммунохимическиереакции с использованием флуоресцентных антител)

Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Существуют методы прямой и непрямой иммунофлуоресценции, в первом случае антиген связывается с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (флуорохромом, например, FITС или TRITC, во втором же антиген связывается с неконъюгированным специфическим антителом (первичным антителом). Флуоресцентная метка конъюгирована со вторичным антителом, специфичным к Fc-фрагменту первичного антитела. Непрямой метод более чувствителен, чем прямой метод. По свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Но для того, чтобы меченные антитела проникли в клетку нужно сделать мембрану более проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран.

7.4 Метод радиоавтографии

Данный метод используется для обнаружения локализации мест синтеза биополимеров, определения путей переноса веществ в клетке, наблюдения за миграцией или свойствами клеток. Для этого применяют регистрацию веществ, меченных изотопами. Способ повторяет метод Беккереля. В среду с клетками вводится предшественник одного из веществ, в котором один из атомов замещен а радиоактивный изотоп. В процессе синтеза меченный атом попадет в саму молекулу и ее можно будет зарегистрировать с помощью фотоэмульсии. Точность этого метода зависит от величины зерна AgBr и от энергии частицы. Поэтому для метода радиоавтографии используют специальную мелкозернистую фотоэмульсию и изотопы с малой энергией. Радиоавтографически нельзя изучать растворимые в воде соединения, так как атомы могут потеряться.

7.5 Метод молекулярной гибридизации

Применение предыдущего метода совместно с методом радиоавтографии дает нам возможность локализовать на хромосоме места с определенной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов. Для этого раствор с меченой нуклеиновой кислотой наносят на препарат с денатурированной ДНК в составе хромосом или ядер. В процессе ренатурации ДНК образуется гибрид меченной нуклеиновой кислоты и комплементарным участком исходной ДНК. Место такой связи регистрируется радиоавтографически. Также метод применяется при окраске нуклеиновой кислоты флуорохромами. Это значит, что мы можем определить положение любой последовательности ДНК.

Поскольку вопрос повышения разрешения всегда стоял остро, ученые пришли к выводу, что в световой микроскопии повысить разрешение можно только за счет использования источника света, который испускает волны с наименьшей длинной. Таким источником может быть раскаленная нить, выбрасывающая поток электронов, который можно сфокусировать, пропуская через магнитное поле. На основе этого был создан световой микроскоп. В настоящее время различают просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ) и растровую электронную микроскопию (РЭМ). Далее будут рассмотрены методы электронной микроскопии.

1 Контрастирование корпускулярных объектов

Существует несколько методов контрастирования. Я рассмотрю два из них: негативное контрастирование и оттенение металлами. Негативное контрастирование производят с помощью ФВК, молибденовоскислого аммония, уранилацетата. после нанесения раствора на исследуемый объект, затем нанести на пленки-подложки и высушить, то исследуемый объект будет погружен в аморфное вещество высокой плотности. Это приведет к тому, что на снимках они будут выглядеть как белые объекты на темном фоне. Растворы могут также проникать вглубь исследуемого объекта и выявлять скрытые структуры. Также существует метод позитивного контраста. В этом случае используются соли тяжелых металлов, которые повышают электронную плотность объекта, таким образом, контраст его повышается. Оттенение металлами - при термическом испарении металлов их частицы разлетаются и осаждаются на исследуемом объекте в виде слоя, чья толщина варьируется в зависимости от направления полета частиц. В местах, где экранирует пучок частиц, пространство будет темнее.

2.2 Ультрамикротомия

Ультрамикротомия представляет собой совокупность приемов для получения сверхтонких срезов с помощью ультратомов, или ультрамикротомов. Ультрамикротомы - аппараты для автоматического приготовления сверхтонких срезов тканей запрограммированной толщины (5-10 нм). Это нужно, потому что пучок электронов, проходя через более толстые объекты, поглощается, вызывает нагревание и приводит к деформации препарата. Процедура их довольна схожа с аналогичной для световой микроскопии. Сначала клетки фиксируют, часто используют ГА (глутаровый альдегид), а затем OsO4, хотя бывает и применение их по отдельности. Затем осуществляют проводку с последним этапом - погружением в ксилол. После препарат заливают эпоксидными смолами (эпон). Теперь препарат, заключенный в твердые блоки можно резать с помощью стеклянных или алмазных ножей для изготовления срезов настолько малой величины используют термическую подачу объекта. Затем идет окраска препарата, обычно уранилацетатом и нитратом свинца, которые контрастируют позитивно. Эта техника изготовления открыла огромные возможности для применения электронной микроскопии почти во всех областях биологии и медицины.

Возможно проводить исследование методом радиоавтографии с использованием сверхтонкозернистых эмульсий и огромных экспозиций. А также исследований без фиксации и заключения в эпон методом криоультрамикротомии. В этом случае объект моментально замораживают до температуры жидкого азота, вода переходит в стекловидное состояние, а процессы моментально тормозятся. Полученные таким образом срезы используют в иммунохимических исследований и т.д.

Для изучения структуры мембранных компонентов используют метод замораживания-скалывания. Метод похож на предыдущий: объект моментально охлаждается до температуры жидкого азота, а затем скалывается охлажденным ножом. Поверхность слоя покрывают слоем металла и углерода, а затем растворяют объект и получают реплику с поверхности скола. При этом можно исследовать рельеф поверхности мембран.

3 Метод высоковольтной микроскопии

Ускоряющее напряжение такого микроскопа составляет 1-3 млн вольт. Такое напряжение позволяет рассматривать объекты большей толщины(1-10 мкм), а использую стереоскопическую съемку, мы можем получить информацию о 3D организации внутриклеточных структур с высоким разрешением.

4 Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии

При использовании этого метода объект покрывается тонким слоем испаренного металла, отражаясь от которого, зонд(пучок электронов) попадает в приемное устройство, откуда далее передается сигнал. При этом получается практически трехмерное изображение поверхности исследуемого объекта, благодаря очень большой глубине фокуса. Также можно получить информацию о химическом составе клеток.

3. Световой и электронный микроскопы

1 Строение светового микроскопа и его основные характеристики

Чтобы понять принцип работы светового микроскопа, необходимо рассмотреть его строение.

Главный прибор биологии является оптической системой, которая состоит из штатива, осветительной и оптической части. В штатив входят башмак; предметный столик с держателем предметного стекла и двумя винтами, перемещающими столик в двух перпендикулярных направлениях; тубус, тубусодержатель; макро- и микровинты, передвигающие тубус в вертикальном направлении.

Для освещения объекта используют естественное рассеянное или искусственное освещение, которое осуществляется посредством стационарно вмонтированного в башмак микроскопа или соединенного через планку осветителя.

В осветительную систему также входят зеркало с плоской и вогнутой поверхностями и конденсор, расположенный под предметным столиком и состоящий из 2 линз, ирисовой диафрагмы и откидывающейся оправы для светофильтров. Оптическая часть включает наборы объективов и окуляров, которые позволяют изучать клетки на разных увеличениях.

Принцип работа светового микроскопа заключается в том, что пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект. Пройдя через него, лучи света попадают в систему линз объектива. Они выстраивают первичное изображение, которое увеличивается при помощи линз окуляра. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличенное изображение объекта.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст.

Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно.

,

где λ - длина волны света осветителя,

α - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в него,- коэффициент преломления среды.

Чем меньше длина волны луча, тем более мелкие детали мы сможем наблюдать через микроскоп. И чем выше нумерическая апертура объектива (n, тем выше разрешение объектива.

Световой микроскоп может повысить разрешающую способность человеческого глаза примерно в 1000 раз. Это является "полезным" увеличением микроскопа. При использовании видимой части спектра света конченый предел разрешения светового микроскопа составляет 0,2-0,3 мкм.

Однако следует отметить, что световая микроскопия позволяет нам увидеть частицы, меньшие предела разрешения. Это можно осуществить благодаря методу "Темного поля" или "Ультрамикроскопии".

Рис. 1 Световой микроскоп: 1 - штатив; 2 - предметный столик; 3 - насадка; 4 - окуляр; 5 - тубус; 6 - устройство смены объективов; 7 - микрообъектив; 8 - конденсор; 9 - механизм перемещения конденсора; 10 - коллектор; 11 - осветительная система; 12 - механизм фокусировки микроскопа.

2 Строение электронного микроскопа

Основная часть электронного микроскопа - полый вакуумный цилиндр (воздух откачан, чтобы исключить взаимодействие электронов с его составляющими и оксисления нити катода). Между катодом и анодом подаётся высокое напряжение, для дополнительного ускорения электронов. В конденсорной линзе(которая представляет собой электромагнит, как и все линзы электронного микроскопа) пучок электронов фокусируется и попадает на изучаемый объект. Прошедшие электроны, формируют на объективной линзе увеличенное первичное изображение, которое увеличивает проекционная линза, и проецируется на экран, который покрыт люминесцентным слоем для свечения при попадании на него электронов.

Рис. 2. Электронный микроскоп: 1 - электронная пушка; 2 - анод; 3 - катушка для юстировки пушки; 4 - клапан пушки; 5 - 1-я конденсорная линза; 6 - 2-я конденсорная линза; 7 - катушка для наклона пучка;8 - конденсор 2 диафрагмы; 9 - объективная линза; 10 - блок образца; 11 -дифракционная диафрагма; 12 - дифракционная линза; 13 - промежуточная линза; 14 - 1-я проекционная линза; 15 - 2-я проекционная линза; 16 - бинокуляр (увеличение 12); 17 - вакуумный блок колонны; 18 - камера для 35-миллиметровой катушечной пленки; 19 - экран для фокусировки; 20 - камера для пластинок; 21 - главный экран; 22 - ионный сорбционный насос.

Библиография

Учебная литература

.Ю.С. Ченцов, Введение в клеточную биологию, издание 4

Интернет сайты

.#"justify">.#"justify">.#"justify">.#"justify">.#"justify">.#"justify">.http://immunologja.ru/267/

Обычные и стереоскопические микроскопы позволяют вести исследования по методу светлого поля : на светлом фоне наблюдается изображение контрастного неокрашенного или цветного объекта. Данный метод применяется наиболее широко.

Метод тёмного поля основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света (применяют специальный конденсор). При этом контрастный светлый объект виден на тёмном фоне.

Метод фазового контраста предназначен для повышения контрастности неокрашенных объектов (микроорганизмов, растительных клеток). Данный метод, в отличие от метода тёмного поля (выявляет только контуры), позволяет рассматривать элементы внутренней структуры объекта, детально изучать особенности срезов тканей или живых клеток.

Метод исследования в поляризованном свете применяется для изучения анизотропных клеточных структур, которым характерна строгая молекулярная ориентация. К таковым относятся, например, внутриклеточные мембраны, нити веретена деления, миофибриллы, мерцательные реснички. В поле зрения поляризационного микроскопа они выглядят ярко светящимися на тёмном фоне.

Метод интерференционной микроскопии основан на разделении светового пучка на два: один проходит через объект, второй - мимо него. В результате первый пучок несколько запаздывает и при интерференции (наложение друг на друга) изменяется яркость световой волны. Вследствие резко выраженной разности оптических путей неокрашенный объект может выглядеть цветным.

Метод исследования в свете люминесценции проводится с помощью микроскопа, на котором установлены особый осветитель, люминесцентные объективы и система специальных светофильтров. Этот метод основан на явлении, возникающем, когда при облучении некоторые вещества и микрообъекты сами начинают светиться в цветовой гамме всего (или большей части) видимого спектра (рис. 4).

Данный метод нашёл широкое применение при цитохимических исследованиях, позволяющих изучать поступление, передвижение, накопление и выделение различных веществ клетки. В медицинской микробиологии его применяют для выявления возбудителей туберкулеза, дифтерии, гонореи, возвратного тифа и др.; в онкологии - для цитодиагностики опухолей.

Электронная микроскопия

Первый электронный микроскоп сконструировал в 1934 г. немецкий учёный Э. Руска. Электронная микроскопия применяется с 1939 г. Это один из важнейших методов исследования структуры объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм).

Современные электронные микроскопы дают возможность получить изображения объектов при увеличениях, приближающихся к 1 000 000.

В электронной микроскопии построение изображения основывается на законах геометрической и волновой оптики, а также на теории электромагнитных полей. В данном случае «линзами» служат электромагнитные катушки. Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, фокусирует пучок электронов так же, как стеклянная линза собирает световой пучок.

По принципу действия современные электронные микроскопы разделяются на просвечивающие и растровые (сканирующие). Первые позволяют изучать образцы в проходящих, а вторые - в рассеянных объектом электронах.

Устройство и принцип действия просвечивающего электронного микроскопа подобны таковым светового микроскопа: аналогом источника света является электронный прожектор (электронная пушка); имеются объективная и конденсорные «линзы»; камера с предметным столиком; проекционная система, которая соответствует окуляру, но передает изображение на люминесцентный экран или фотографическую пластинку. Такой аппарат весит несколько тонн и достигает в высоту 2,5–3 м (рис. 5).

Источником электронов служит раскаленная вольфрамовая нить (катод). Излучаемые электроны ускоряются сильным электрическим полем и, проходя через отверстие в аноде, собираются в узкий пучок. Система «катод–анод» называется электронным прожектором.

Исследуемый образец находится в магнитном поле объективной линзы - самой важной линзы, которая в итоге определяет максимальное разрешение микроскопа. Эта линза направляет прошедший через образец поток электронов в систему проекционных линз, а последние - на люминесцентный экран или фотографическую пластинку.

В результате бомбардировки электронами фотопластинки или экрана, покрытого специальным флуоресцирующим составом, получаетсявидимое увеличенное изображение.

При столкновении с веществом электроны в той или иной степени меняют траекторию движения. Электронный поток рассеивается даже воздухом, поэтому в колонне работающего электронного микроскопа поддерживается глубокий вакуум, а исследуемый объект должен иметь минимальную толщину.

Участки препарата с повышенной плотностью или увеличенной толщиной, местá расположения тяжёлых атомов сильно отклоняют электроны, и потому выглядят тёмными зонами на светлом фоне (метод светлого поля).

Однако электромагнитные поля можно отрегулировать так, чтобы в диафрагму объектива попадали только рассеянные электроны. Тогда образец выглядит светлым на тёмном фоне (метод тёмного поля).

Изображение можно наблюдать через присоединенный к прибору бинокулярный световой микроскоп, выводить на телевизионный экран или записывать на видеоленту. Если регистрация электронов производится на фотографической пластинке, то получают снимок объекта - электронограмму (рис. 6). Электронограммы можно ещё увеличить примерно в 10 раз без потери чёткости.

Рис. 6. Электронограммы: А - митохондрия (метод светлого поля), Б - участок кристы митохондрии (метод тёмного поля)

Электронный микроскоп сканирующего типа изобретён в 50-х годах ХХ века. Его магнитные линзы фокусируют испускаемые электроны в пучок очень маленького диаметра (всего несколько десятков нанометров), называемый электронным зòндом . Последний перемещается по объекту подобно лучу, обегающему экран радиолокатора, и за определённое время сканирует заданную площадь поверхности образца. В результате на экране возникает рельефное изображение сканируемой поверхности объекта. Такой режим работы микроскопа позволяет получать высококачественные объёмные электронограммы (рис. 7).

Основным недостатком электронной микроскопии является тот факт, что она не позволяет наблюдать живые объекты, поскольку исследуемый материал помещается в условия вакуума и подвергается радиационному повреждению (электронный поток представляет собой ионизирующее излучение).

Применение электронной микроскопии в биологии и медицине направлено на исследования таких объектов, которые невозможно обнаружить с помощью обычного светового микроскопа. Путём электронной микроскопии выявлены детали строения биологических мембран, митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и других органоидов клетки. Данный метод широко применяется для изучения тонкого строения про- и эукариотических клеток, вирусов, бактериофагов, прочих субмикроскопических объектов.

В области медико-биологических исследований современные электронные микроскопы позволяют получить изображение даже отдельных макромолекул биополимеров (нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов). Тем самым они вносят огромный вклад в развитие современной медицины, дают возможность глубже вникнуть в сложную биологическую сущность человека.

Для того чтобы можно было рассмотреть мелкий объект, необходимо его увеличить. Увеличение достигается с помощью системы линз, расположенных между глазом исследователя и объектом. Огромное значение для микроскопических наблюдений имеют контрастность и разрешение, позволяющие четко отличать объект от фона и раздельно видеть очень близкие детали изображения. В зависимости от принципа создания изображения микроскопия делится на световую, электронную и лазерную.

Современные световые микроскопы являются сложными и имеют три системы линз (рис. 2.1). Система конденсора отвечает за правильное освещение поля зрения и расположена между источником света и объектом. При внешнем источнике света лучи направляются в конденсор зеркалом. Многие современные микроскопы имеют встроенный источник света, и зеркало у них отсутствует. Увеличивают изображение системы линз объектива, обращенного к объекту, и окуляра, соприкасающегося с глазом исследователя. Общее увеличение определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. Разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны используемого света, оптических свойств линз и показателя преломления среды, контактирующей с наружной линзой объектива.

Рис. 2.1.

Самым простым приемом, повышающим разрешающую способность микроскопа, является применение иммерсии. Между наружной линзой объектива и объектом помещают каплю жидкости, показатель преломления которой превышает показатель преломления воздуха. Для каждой жидкости используют специальный иммерсионный объектив. Наиболее распространены водные (с белым кольцом) и масляные (с черным кольцом) объективы. Модификациями обычной светопольной микроскопии являются ультрафиолетовая, темнопольная, фазово-контрастная микроскопия.

Применение более коротковолновых ультрафиолетовых лучей также позволяет повысить разрешающую способность микроскопа. Однако использование специальных источников света и кварцевой оптики приводят к существенному удорожанию микроскопических исследований.

В темнопольной микроскопии объект освещается только косыми боковыми лучами с помощью специального темнопольного конденсора. При таком освещении поле зрения остается темным, а мелкие частицы светятся отраженным светом. Темнопольная микроскопия позволяет различить контуры объектов, лежащих за пределами видимости обычного микроскопа, например, прокариотических жгутиков. Однако при таком способе наблюдения нельзя рассмотреть внутреннее строение объекта.

При применении фазово-контрастного устройства можно наблюдать живые прозрачные объекты, которые практически не отличаются по плотности от окружающего фона. Цвет и яркость проходящих через такие объекты лучей почти не меняются, но происходит фазовое смещение, не регистрируемое человеческим глазом. Фазово-контрастное устройство, применяемое как приставка к обычному микроскопу, преобразует фазовые различия световых волн в изменения их цвета и яркости. Прозрачные объекты становятся более четкими, и в клетках крупных микроорганизмов можно наблюдать даже отдельные структуры и включения.