Световой микроскопии в растительной клетке можно различить. Микроскоп и микроскопические методы исследования. Устройство и назначение световых микроскопов

Световой микроскоп, главный прибор биологии, представляет собой оптическую систему, состоящую из конденсатора, объектива. Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект (рис. 6). Пройдя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива; они строят первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив. В современных микроскопах объективы сменные, что позволяет изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность. Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например, путем проекции на экран (до 10 5 раз). Вычислено, что разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно, будет равно

d = 0,61 -----------

где l - длина волны света, используемого для освещения объекта; n – коэффициент преломления среды; a - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив. Разрешение микроскопа зависит от длины волны – чем она меньше, тем меньшего размера деталь мы можем увидеть, и от нумерической апертуры объектива (n sin a) – чем она выше, тем выше разрешение. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.

Но все же в световом микроскопе можно видеть частицы меньшей величины, чем 0,2 мкм. Это метод «темного поля», или, как его называли раньше, метод «ультрамикроскопии». Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.

Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать в проходящем свете, то в них различаются только крупные детали из-за того, что они обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световых лучей, чем окружающая среда. Большая же часть клеточных компонентов мало отличается по этим свойствам как от среды (воды или тканевых растворов), так и друг от друга и поэтому мало заметны и не контрастны. Для их изучения приходится изменять освещенность (теряя при этом в четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Один из таких приемов – метод фазово-контрастной микроскопии , широко использующийся для наблюдений за живыми клетками. Он основан на том, что отдельные участки прозрачной в общем клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света. Последняя зависит от величины амплитуды световой волны. В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.

Сходный прием используется в интерференционном микроскопе . Он устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.

С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (например, волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90 о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

Конфокальный микроскоп и изображения, сделанные с его помощью: растрескивание пыльника, сосуды ксилемы, хлоропласты в клетках рыльца.

Световая микроскопия

Одним из главных методов цитологии на сегодняшний день остается микроскопия, предназначенная для изучения структуры клетки, она широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях. Изобретение микроскопа связывают с именами Галилео Галилея (итал.) и братьев Янсен (гол.) в 1609-1611 гг. Термин «микроскоп» был предложен Фабер (нем.) в 1625 г.

На настоящий момент существует два основных вида микроскопии - световая и электронная. Различия между ними состоят в принципе рассмотрения объекта. В первом случае объект рассматривают в потоке видимой части электромагнитного излучения (длина волны = 400-750 нм), во втором случае - в потоке электронов. Эти два метода имеют разную разрешающую способность. Разрешающая способность или предел разрешения - это минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно. Предел разрешения микроскопа задается длиной волны потока излучения, в котором изучается объект. Поэтому излучение данной длины волны может быть использовано для исследования только таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длиной волны самого излучения. Предел разрешающей способности световой микроскопии был достигнут конструкторами микроскопов еще в конце 19 века, и составил 0,2 мкм. Это значит, что два объекта, если они разделены расстоянием менее 0,2 мкм, будут выглядеть как одно целое, даже если мы будем сильно увеличивать изображение, например, проецируя его на экран. Поэтому, с помощью светового микроскопа не удается рассмотреть две центриоли в клеточном центре, они выглядят как одна точка (надо сказать, что в современных микроскопах, производимых серийно, максимальная разрешающая способность не реализуется). В связи с ограничением разрешающей способности светового микроскопа он может быть использован для изучения ограниченного числа внутриклеточных структур, включая: ядро, пластиды, крупные вакуоли, оболочку растительной клетки. Мельчайшими объектами, четко различимыми в световом микроскопе являются бактерии и митохондрии, размеры которых составляют около 500 нм (0,5 мкм), более мелкие объекты видны нечетко, повышение точности обработки линз не может преодолеть это ограничение, которое задано волновой природой света.

Разрешающая способность зависит не только от длины волны источника освещения, но и от коэффициента преломления среды, через которую происходит наблюдение объекта, а также от угла наклона, под которым лучи освещения входят в объектив. Стандартный набор объективов микроскопа составляют: объективы малого увеличения (х8) с апертурой А=0,2 и объективы большого увеличения (х20) с А= 0,40 и - (х40) с А= 0,65. Эти объективы называют «сухими», так как рассмотрение объекта с их помощью происходит через воздушную среду (коэффициент преломления n=1). Но большинство микроскопов оснащены, кроме этого, специальными иммерсионными объективами, для которых необходима специальная иммерсионная среда (n=1). Такой средой может быть вода, объектив х40 ВИ имеет апертуру 0,75. Наиболее распространена масляная иммерсия (n=1,51), при х90 значение апертуры объектива А=1,25. В случае использования иммерсии улучшается разрешающая способность светового микроскопа. Однако, у объективов с высокой разрешающей способностью имеются недостатки: небольшая глубина резкости и невысокая контрастность.

Самым распространенным методом световой микроскопии является метод светлого поля, при котором световые лучи осветителя проходят через объект и попадают в объектив. Таким способом изучают клетки фиксированные и окрашенные. Открытие основных клеточных структур связано с разработкой и применением набора красителей, которые избирательно окрашивают компоненты клетки и обеспечивают контраст для их наблюдения. Имеется большое разнообразие красителей. Некоторые из них извлекаются из растений и животных, до сих пор не существует их синтетических аналогов. Например, широко используемый гематоксилин - экстракт тропического кампешевого дерева, кармин - пигмент жирового тела некоторых видов тлей. Все это так называемые ядерные красители, окрашивающие структуры, содержащие нуклеиновые кислоты. Применение неядерного красителя -азотнокислого серебра, позволило Камилло Гольджи в 1898 г. наблюдать и описать то, что позднее было названо аппаратом Гольджи.

Окрашивание живой клетки возможно лишь в редких случаях, поэтому для их изучения используют другие методы. В отличие от метода светлого поля при наблюдении объектов методом темного поля лучи осветителя не попадают в объектив и изображение создается только рассеянными лучами, идущими от объекта. При этом на темном фоне можно увидеть светящиеся частицы, которые по своим размерам меньше, чем разрешающая способность объектива, хотя размеры и форму частиц определить трудно. Темнопольная микроскопия в проходящем свете используется для изучения прозрачных объектов обычно невидимых в светлом поле и, особенно, для рассмотрения живых клеток. Совершенно по-разному на темном фоне выглядят живые и погибающие клетки. Протопласт погибающих клеток светится ярче, объяснения этому факту нет. Изобретен этот метод Зигмонди (австр.) в 1912 г. В световой микроскоп можно различать объекты, изменяющие амплитуду лучей освещения, однако живые клетки прозрачны для видимого света и лучи, проходя через клетку, практически не меняют амплитуды. Человеческий глаз не способен воспринимать смещение фазы лучей без изменения амплитуды. Поэтому специально для изучения живых клеток используются методы фазово-контрастной (изобретен Зернике (голл.) в 1934 г.) и интерференционной микроскопии (изобретен Лебедевым в 1932 г.). В таких системах прохождение света через живую клетку сопровождается изменением фазы световой волны. Свет задерживается, проходя через толстые участки клетки, например, через ядро. Возникает рекомбинация двух наборов волн, которые создают изображение клеточных структур.

Для изучения объектов, обладающих двойным лучепреломлением (крахмальные зерна, растительные волокна, кристаллы) используют поляризационную микроскопию, основы которой заложил Эбнер в 1882 г. В этом методе используют специальное устройство поляризатор, который преобразует разнонаправленные волны света и они приобретают одно направление.

При флуоресцентной микроскопии объект рассматривают в свете, излучаемом им самим. Первый люминесцентный микроскоп сконструировали Келлер и Зиндентокф в 1908 г. В основе этого метода лежит способность ряда веществ, при освещении коротковолновыми лучами (фиолетовыми или ультрафиолетовыми), светиться. Часто люминесцентная микроскопия используется для выявления специфических белков, антител, впервые использовал флуорохромы для связывания с антителами Кунс, и эта реакция получила его имя. В цитоэмбриологических исследованиях этот метод используют для изучения структур, содержащих углевод каллозу. Для этого метода используют специальную оптическую систему с ртутной лампой, связанную со световым микроскопом.

В последнее время возможности световой микроскопии существенно увеличились благодаря использованию чувствительных видеосистем. Изображение, созданное световым микроскопом, подвергается обработке в видеокамере. Оно очищается от «шумов», преобразуется в цифровые сигналы и направляется в компьютер, где подвергается дополнительной обработке для извлечения скрытой информации. Компьютерная интерференционная микроскопия позволяет достичь сильного контраста и анализировать прозрачные объекты и живые клетки.

Электронная микроскопия

Длительные непрерывные усилия по улучшению методов исследования принесли желаемые результаты в конце второй мировой войны. Именно тогда, благодаря удивительному стечению обстоятельств, почти в одно и то же время, ученые обогатились рядом новых мощных инструментов и методов исследования. В морфологии таким инструментом стал электронный микроскоп. Созданный еще в 30-е г. 20 века, он обладал достаточной разрешающей способностью, позволяющей проникнуть в клетку, вплоть до структур размером в нанометр. Вместе с тем, электронный пучок имел слабую проникающую способность, и это требовало приготовления очень тонких образцов материала и высокого вакуума. Такие жесткие требования создавали серьезные трудности, но в удивительно короткий срок удалось разработать методы для подготовки образцов тканей и сконструировать приборы для получения из них тонких срезов. Качество объектов неуклонно повышалось и к началу 60-ых годов были описаны многие из ранее неизвестных клеточных структур.

Итак, разрешающая способность электронного микроскопа намного выше, чем светового. Теоретически при напряжении 100000 В его разрешение составляет 0,002 нм, но за счет коррекции электронных линз оно уменьшается и в реальности составляет у современных электронных микроскопов 0,1 нм. Значительные трудности наблюдения биологических объектов еще более снижают нормальное разрешение, оно не превышает 2 нм. Тем не менее, это в 100 раз больше, чем у светового микроскопа, поэтому электронную микроскопию называют ультрамикроскопической.

Общая схема просвечивающего электронного микроскопа напоминает схему светового. Он существенно больше светового и как бы перевернут. В качестве источника излучения у электронного микроскопа служит нить катода, испускающая электроны (электронная пушка). Электроны испускаются с вершины цилиндрической колонны высотой около двух метров. Чтобы не было препятствий для движения электронов, происходит это в вакууме, разгоняются электроны анодом и проникают через крошечное отверстие в нижнюю часть колонны узким электронным лучом. Электронный луч фокусируется кольцевыми магнитами, расположенными вдоль колонны, они действуют подобно стеклянным линзам светового микроскопа. Образец помещается на пути электронного пучка. В момент его прохождения через образец часть электронов рассеивается в соответствии с плотностью вещества, остаток электронов фокусируется, образуя изображение на фотопластинке или на экране.

Первый электронный микроскоп был создан Сименсом в 1939 г. Он позволил увидеть в клетке множество удивительных структур. Но для этого пришлось изобрести совершенно новые методы приготовления препаратов, которые стали применять с 1952 г. Фиксация клеток при этом проводится глутаральдегидом, ковалентно связывающим белки, а затем осмиевой кислотой, стабилизирующей белковые и липидные слои. Образец обезвоживают и пропитывают смолами, образующими после полимеризации твердый блок. Срезы для электронной микроскопии должны быть примерно 1:200 часть толщины одной клетки. Для изготовления таких срезов был создан ультрамикротом (1953) , в котором используются стеклянные или алмазные ножи. Полученные срезы помещают на специальную медную сеточку. Изображение в электронном микроскопе зависит от рассеивания электронов, которое определяется атомным числом вещества. Биологические объекты состоят главным образом из углерода, кислорода и водорода, которые обладают низким атомным числом. Для усиления контраста их импрегнируют тяжелыми металлами, такими как осмий, уран, свинец. Тонкие срезы при просвечивающей электронной микроскопии не позволяют судить о трехмерной структуре клетки, компенсировать этот недостаток можно серией срезов, по которой проводится реконструкция клетки. Это долгий процесс.

Существует и прямой метод изучения трехмерного строения биологических объектов - сканирующая электронная микроскопия - она была создана в 1965 г. В этом случае для получения изображения используют электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью объекта, который должен быть зафиксирован, высушен и покрыт пленкой тяжелого металла. Этот метод применим только для изучения поверхностей и его разрешение невелико - около 10 нм.

Электронный микроскоп

Просвечивающий, зондовый и растровый электронные микроскопы. Электронмикроскопическое изображение поверхности пыльника и пыльцевого зерна

Химические методы исследования клетки

Классический световой микроскоп обладает низкой разрешающей способностью, что не позволяет изучать детали строения клетки размером менее 0,25 мкм. Второй этап изучения клетки относится к тому времени, когда микроскописты трудились над усовершенствованием своих приборов. В это же время - конец 18 в. - французский ученый Антуан де Лавуазье и англичанин Джозеф Пристли создают новую науку - химию. В отличие от морфологии, которая развивается от сложного к простому, химия продвигается от простого к сложному. Начиналась химия с идентификации элементов, атомов и затем продвигалась по пути изучения некоторых их наиболее простых комбинаций - молекул.

Пересечь границу между неорганической и органической химией и позволить проникнуть в живой мир химии помог, впервые проведенный в 1828 г. Немецким ученым Фридрихом Велером, синтез биологической молекулы мочевины. Это стало началом применения химического подхода к изучению клетки. В последующие сто лет были открыты, очищены, структурно изучены и получены синтетическим путем аминокислоты, сахара, жиры, пурины, пиримидины и др. небольшие молекулы. Ученым удалось составить представление о метаболизме этих веществ в организме и путях образования из них основных биологических молекул: белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот. Но опять возникли труднопреодолимые препятствия на пути прогресса: перед сложностями структурной комплексности этих крупных молекул классическая химия оказалась бессильна. В течение длительного времени клетки изучали в основном путем наблюдения за ними. Но по мере развития экспериментального метода в естественных науках к нему начали прибегать и при исследовании живых организмов. Это облегчалось мощными биомедицинскими исследованиями проводимыми во второй половине 19 в. В начале 20 в. американец Росс Гаррисон и француз Алексис Каррель установили, что клетки животных можно культивировать в пробирке наподобие того как это делают с одноклеточными организмами. Тем самым они продемонстрировали способность клеток к независимой жизни и создали метод культивирования, который сейчас является одним из самых актуальных.

Но все эти методы, по сути революционные, по-прежнему, были непрямыми, клетка оставалась закрытым черным ящиком. Сохранялась неизведанной огромная пропасть между наименьшей различимой в световом микроскопе частицей и наиболее крупной молекулой, доступной химическому исследованию. В этом неизведанном пространстве были скрыты важные понятия и концепции, неизвестными оставались функции, описанных клеточных структур, их связь с известными биомолекулами - без всего этого жизнь клетки оставалась неразгаданной.

В свою очередь биохимия также обогатилась целым рядом принципиально новых приборов и методов. Особый интерес представляла хроматография, основанная на очень простом феномене - образовании каемки или ореола вокруг пятна (то, что мы видим, когда пытаемся вывести пятно специальным раствором). В основе этого явления лежат различия в скорости движения разных красок в потоке растекающейся жидкости. В начале 20 века русский физиолог и биохимик Михаил Семенович Цвет первым использовал этот феномен. Пропуская экстракт из листьев через вертикальную трубку, заполненную адсорбирующим порошком, он сумел разделить основные пигменты листьев - зеленый и оранжевый - и получить их в виде отдельных окрашенных полос или колец вдоль трубки. Свой метод он назвал хроматография (греч. khroma - цвет, graphein - записывать). Цвет умер относительно молодым и потенциальные возможности его метода оставались неиспользованными до начала 40-х гг. Сейчас существует множество вариантов хроматографии - применимой ко всем веществам, которые могут быть идентифицированы химически.

Близким к хроматографии является электрофорез в геле, при котором не поток растворителя, а электродвижущая сила способствует передвижению и разделению электрически заряженных компонентов. Эти методы произвели переворот в области химического анализа. Теперь на следовых количествах смеси практически любого состава можно провести анализ.

Вторым методом, радикально изменившем химическое исследование живых клеток, явился метод изотопного мечения. Изотопы - это разновидности одного и того же химического элемента, отличающиеся по атомной массе. Некоторые изотопы существуют в природе, многие могут быть получены искусственным путем в процессе ядерных реакций. Изотопы используются для специфического мечения определенных молекул, такие молекулы можно отличить от им родственных без нарушения общей структуры. Этот метод используется при анализе биосинтетических процессов, которые не могли быть изучены другим способом. Например, с получением меченых аминокислот появилась возможность изучать их соединение в белки в живом организме или в экспериментальных условиях, даже, несмотря на бесконечно малое количество вновь образованного белка, благодаря его радиоактивности. Широкое распространение этот метод получил с созданием атомных реакторов и производством широкого спектра радиоизотопов. Без метода меченых атомов достижения клеточной и молекулярной биологии были бы невозможны.

Таким образом, и морфология, и биохимия, обогащенные новыми методами постоянно совершенствовались, разрыв между их знанием становился все меньше и исчез совсем, когда появилась возможность разделить клетку на части таким образом, чтобы каждую часть можно было бы независимо изучить.

Методы, применяемые для такого фракционирования, основываются главным образом на центрифугировании. Этот метод использует различия в физических свойствах, в частности величине и плотности, тех или иных составных частей клетки для отделения их друг от друга. Это позволило изучить большую часть клетки и объединить морфологическое и биохимическое знание.

Однако одна часть клетки - ее важнейшая центральная часть, ядро - оставалась в значительной степени недоступной, пока не произошло еще одно событие. А началось оно с попытки проанализировать с помощью генетики особенности некоторых простых вирусов, инфицирующих бактерии и названные бактериофагами или пожирателями бактерий. Это исследование оказалось верным подходом к решению проблемы генетической организации, которая даже у простейших неклеточных организмов была необыкновенно сложной. Длительное время новая дисциплина известная сегодня как молекулярная биология, ограничивалась изучением вирусов и бактерий, но затем она буквально ворвалась в эукариотическую клетку, позволив изучать регуляцию жизнедеятельности клетки.

Для изучения молекулярных основ организации клетки необходим детальный биохимический анализ. Для него необходимо значительное количество клеток определенного типа, поэтому невозможно использовать кусочки ткани, ведь они содержат клетки разных типов. На первом этапе работы кусочки ткани превращают в суспензию. Это можно сделать, разрушив межклеточное вещество и межклеточные связи. Для этого ткань обрабатывают протеолитическими ферментами, разрушающими белки (трипсин, коллагеназа). В соединении клеток, их слипании большую роль играет кальций, поэтому используют и вещества хелатирующие, которые связывают кальций. Затем ткани подвергают мягкому механическому разрушению и разделяют на отдельные клетки. Второй этап - разделение суспензии на отдельные фракции. Для этого используют центрифугирование, с помощью которого крупные клетки отделяют от мелких, а легкие - от тяжелых или используют антитела, и способность клеток с разной прочностью прикрепляться к стеклу или пластмассе. Третий этап - введение выделенных клеток в культуру. Первые опыты были проведены в 1907 г. Гаррисоном, он культивировал спинной мозг амфибий в сгустке плазмы. Среды для культивирования имеют довольно сложный состав. Стандартная среда была разработана в начале 70-х, она содержит набор из 13 аминокислот, 8 витаминов, минеральные соли. Кроме того, в среду могут включаться глюкоза, пенициллин, стрептомицин, сыворотка лошади или теленка. Как показали Хайфлик и Мурхед в 1961 г., большинство клеток млекопитающих погибает в культуре после определенного числа делений. Клетки кожи человека делятся в культуре 50-100 раз. Однако в культуре иногда появляются мутантные клетки, которые могут размножаться бесконечно, образуя клеточную линию. В 1952 г. была выделена перевиваемая клеточная линия из раковой опухоли шейки матки, известная как линия HeLa. Такие линии хранят при температуре -70 С, после размораживания они сохраняют способность делиться. Метод культивирования растительных клеток был разработан к 1964 г. Пользуясь им, удалось вырастить in vitro целое растение моркови из клеток корня.

Микроскопические исследования как метод познания клетки

Диаметр типичной клетки животных составляет 10-20 мкм, что в пять раз меньше мельчайшей видимой частицы. Только с появлением совершенных световых микроскопов в начале XIX века удалось установить тот факт, что все ткани животных и растений состоят из отдельных клеток. Это открытие, обобщенное в форме клеточной теории Шлейденом и Шванном в 1838 году, знаменует собой начало клеточной биологии.

Будучи чрезвычайно малыми по размерам, животные клетки к тому же бесцветны и прозрачны: следовательно, открытие их основных структур стало возможным благодаря разработке набора красителей в конце XIX столетия. Именно красители обеспечили достаточный контраст для наблюдения субклеточных структур. Сходная ситуация наблюдалась в начале 40-х годов нашего столетия, когда изобретение мощного электронного микроскопа потребовало новых методов сохранения и окраски клеток. И только после того, как они были разработаны, начала проявляться вся сложность клеточной структуры. В основе микроскопии как методологии до сих пор лежат способы приготовления образца и возможности самого микроскопа.

Обычная оптическая микроскопия

В общем случае излучение данной длины волны может быть использовано для изучения только таких структур, минимальные размеры которых еще сопоставимы с длиной волны самого излучения. Этот принцип ограничивает возможности любого микроскопа. Предел разрешения светового микроскопа задается длиной световой волны, которая для видимого света лежит в пределах от 0,4 мкм (фиолетовый) до 0,7 мкм (темно-красный). Из этого следует, что самыми маленькими объектами, которые еще можно наблюдать в световой микроскоп, являются бактерии и митохондрии (их ширина ~ 0,5 мкм). Более мелкие элементы клетки искажаются эффектами, вызванными волновой природой света.

Для приготовления постоянного препарата, который можно окрасить и наблюдать в микроскоп, клетки обрабатывают фиксирующим агентом с тем, чтобы иммобилизировать, убить и сохранить их. В современных методах, как правило, используется обработка альдегидами, например, формальдегидом или глутаральдегидом, которые формируют ковалентные связи со свободными аминогруппами белков и, таким образом, сшивают соседние молекулы.

После фиксации ткани обычно режут на очень тонкие "ломтики" (срезы) на микротоме. Срезы толщиной от 1 до 10 мкм помещают на поверхность предметного стекла. В качестве заключающих сред используют парафин или специальную смолу. В жидком виде эти среды пропитывают и окружают фиксированную ткань: затем они затвердевают при охлаждении или за счет полимеризации, образуя твердый блок, который удобно резать на микротоме.

Существует серьезная опасность того, что процедуры фиксации или заключения могут повредить структуру клеток или клеточных макромолекул. Вот почему предложен другой метод приготовления срезов - быстрое замораживание. Замороженную ткань режут на криостате в специальном микротоме, установленном в холодной камере.

В содержимом большинства клеток, состоящих, как правило, на 70% из воды, практически отсутствуют компоненты, способные помешать прохождению световых лучей. Поэтому в естественном состоянии большинство клеток даже после фиксации и приготовления срезов практически невидимы в обычном световом микроскопе. Одна из возможностей их увидеть состоит в окраске клеток красителями.

Флуоресцентная микроскопия

Поскольку большинство макромолекул представлены в клетках относительно незначительным числом копий, одна или две молекулы красителя, связанные с макромолекулой, могут оставаться незамеченными. Альтернативный подход к проблеме чувствительности состоит в использовании флуоресценции.

Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул.

Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный световой микроскоп, но здесь свет от осветителя, излучаемый мощным источником, проходит через два набора фильтров - один для задержания света перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образца.

Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Например, флуоресцирующие красители могут быть связаны с молекулами антител, что сразу же превращает их в высокоспецифические и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со специфическими макромолекулами на поверхности живой либо внутри фиксированной клетки. Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом.

Фазово-контрастная и интерференционная микроскопия

Возможность потери или нарушения образцов в процессе их приготовления всегда беспокоила микроскопистов. Единственный способ решить эту проблему состоит в изучении живых клеток без фиксации или замораживания. Для этой цели очень полезны микроскопы со специальными оптическими системами.

При прохождении света через живую клетку фаза световой волны меняется согласно коэффициенту рефракции клетки: свет, проходящий через относительно тонкие или относительно толстые участки клетки, такие, как ядро, задерживается, и его фаза соответственно сдвигается по отношению к фазе света, проходящего через относительно тонкие участки цитоплазмы. Как в фазово-контрастном, так и в интерференционном микроскопе используются эффекты интерференции, возникающие при рекомбинации двух наборов волн, которые и создают изображение клеточных структур. Оба типа световой микроскопии широко используются для наблюдения живых клеток.

Простейший способ разглядеть детали клеточной структуры - наблюдать свет, рассеивающийся различными компонентами клетки. В темнопольном микроскопе лучи от осветителя направляются сбоку и при этом в линзы микроскопа попадают только рассеянные лучи. Соответственно клетка выглядит как освещенный объект на темном поле. Одним из основных преимуществ фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать движение клеток в процессе митоза и миграции

Видеокамеры и соответствующие технологии обработки изображения значительно увеличили возможности световой микроскопии. Это позволило наблюдать клетки в течение длительного времени при низкой освещенности, исключая длительное воздействие яркого света (или тепла). Поскольку изображение создается видеокамерой в форме электронных сигналов, его можно соответствующим образом преобразовать в числовые сигналы, направить в компьютер и затем подвергнуть дополнительной обработке для извлечения скрытой информации. Эти и подобные методы обработки изображения позволяют компенсировать оптические недостатки микроскопов и практически достичь предела разрешения.

Высокий контраст, достижим с помощью компьютерной интерференционной микроскопии, позволяет наблюдать даже очень мелкие объекты, как, например, отдельные микротрубочки диаметр которых менее одной десятой длины волны света (0,025 мкм). Отдельные микротрубочки можно увидеть и с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако в обоих случаях неизбежны эффекты дифракции, сильно изменяющие изображение. Диаметр микротрубочек при этом завышается (0,2 мкм), что не позволяет отличать отдельные микротрубочки от пучка из нескольких микротрубочек.

Световая микроскопия применяется с целью изучения объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности* невооружённого глаза человека (составляет примерно 0,1–0,2 мм).

Препарат для световой микроскопии (микропрепарат) - это объект, помещённый на предметное стекло и защищённый сверху покровным стеклом. Исследуя микропрепарат с помощью оптических приборов, получают увеличенное изображение объекта или его участка.

Элементарным приспособлением для получения увеличенного изображения предметов является лупа - двояковыпуклая линза, вставленная в оправу-держатель. В биологии используется препаровальная лупа со сменными линзами-окулярами (рис. 1), которая увеличивает предметы в 10–40 раз.

Чтобы получить б?льшее увеличение объекта, используют световой микроскоп. В медико-биологических исследованиях чаще всего применяются:

прямые микроскопы проходящего света (биологические);

инвертированные биологические микроскопы;

стереоскопические микроскопы;

анализаторы изображения.

Устройство и назначение световых микроскопов

Биологический микроскоп предназначен для наблюдения в проходящем свете окрашенных и неокрашенных объектов. Типичный световой микроскоп (рис. 2) состоит из трёх основных частей: механической, осветительной (электрической) и оптической.

Механическая часть включает штатив, предметный столик, кремальеру (макрометрический винт), микрометрический винт, тубус и револьвер.

Штатив является главным механическим блоком микроскопа. Он состоит из тубусодержателя (колонки) и основания. На колонке монтируются основные части прибора:

револьверное устройство - вращающийся механизм смены объективов, который крепится на «салазках» с помощью специальных направляющих;

система винтов грубой (макрометрической) и точной (микрометрической) настроек микроскопа;

предметный столик (неподвижный или перемещающийся) для размещения объекта наблюдения;

узел крепления и перемещения конденсора;

узел крепления сменных насадок (фотографических, телевизионных и т. п.) - если предусмотрен конструкцией прибора.

Основание придает микроскопу устойчивость; на нём также устанавливаются накладные или встроенные источники освещения.

Осветительная часть обеспечивает равномерное освещение объекта. Она включает зеркало (либо электрический осветитель) и конденсор.

Зеркало микроскопа двухстороннее - с плоской и вогнутой отражающими поверхностями. Вогнутая поверхность применяется при естественном освещении, а плоская - при искусственном.

Конденсор - это система линз, собирающая световые лучи в пучок с меньшим поперечным сечением. Диаметр светового пучка можно регулировать, изменяя просвет диафрагмы конденсора с помощью специального рычажка.

Оптическая система микроскопа состоит из окуляра и объектива, связанных полой трубкой - тубусом .

Окуляр вставлен в верхнее отверстие тубуса; предназначен для проекции изображения на сетчатку глаза наблюдателя. На передней или верхней части корпуса окуляра имеется маркировка, указывающая его увеличение и размер видимого поля изображения (в мм); например, «10?/18».

В учебном микроскопе используются сменные окуляры с увеличением 7 ?, 10 ? и 15 ?, нередко снабжённые микроуказкой в виде радиальной тёмной полоски. Окуляр состоит из двух групп линз: глазной (ближайшая к глазу наблюдателя) и полевой (направлена к объективу).

Объектив ввинчен в револьвер и расположен у нижнего конца тубуса. Он включает в себя несколько линз, общее число которых может достигать 14. Чем больше линз, тем выше качество изображения.

На корпусе каждого объектива указываются данные о нём:

увеличение - 4?, 8?, … 90?, 100?;

апертура (диаметр полевой линзы) - 0,20; 0,65;

дополнительная буквенная маркировка, если объектив специальный (фазовый - Ф (Рh ), поляризационный - П (Pol ), люминесцентный - Л (L ) и т. п.).

На иммерсионных объективах имеются маркировка цветным кольцом и буквенное обозначение типа иммерсии * : чёрное кольцо - МИ (0il ), белое - ВИ (W ), оранжевое - ГИ (Glyc ). Иммерсионные объективы позволяют получить максимально возможное в световой микроскопии увеличение объекта или его участка.

Объективы бывают малых (до 10?); больших (до 50?) и сверхбольших (около 100?) увеличений. В учебном микроскопе чаще всего используются два вида объективов: малого увеличения (в 8 раз) и большого (в 40 раз).

Общее увеличение микроскопа определяется путём умножения показателей увеличений объектива и окуляра. Например, общее увеличение микроскопа с объективом 40х и окуляром 7? будет 40 · 7 = 280?.

Если между объективом и окуляром расположена одна или несколько увеличивающих систем, то общее увеличение микроскопа равно произведению показателей всех увеличений. Современные световые микроскопы могут увеличивать объект примерно в 1500–2000 раз.

Инвертированный и стереоскопический микроскопы изображены на рис. 3.

Инвертированный микроскоп представляет собой «перевернутую» конструкцию обычного микроскопа: у него осветитель расположен над объектом, а объективы - под предметным столиком. Такое устройство обеспечивает свободный доступ инструмента (манипулятора, палочки, пипетки) к исследуемому образцу в процессе наблюдения.

Р
ис. 3. Инвертированный (А ) и стереоскопический (Б ) микроскопы

Для инвертированных микроскопов толщина объекта не играет большой роли: с его помощью можно исследовать габаритные объекты или объекты, расположенные в лабораторной посуде (в стеклянных колбах, в чашках Петри).

Стереоскопический микроскоп позволяет наблюдать объект обоими глазами по оптическим осям, наклонённым под углом 12–17° друг к другу. При этом возникает визуальный эффект объёмного изображения предмета. Для стереомикроскопии толщина исследуемого образца также не имеет особого значения.

Анализаторы изображения применяются с конца 80-х годов ХХ века и основаны на применении современных методов обработки изображения объекта с элементами сбора, систематизации и анализа информации. Причём базой может служить любой микроскоп, имеющий насадку для фото-, видео- или цифровой камеры и дополнительный вывод изображения на видеоконтрольный монитор. Изображение передаётся в компьютер, оснащённый специальной программой для анализа изображений. С помощью компьютера можно улучшить и отредактировать качество введенного изображения, подчеркнуть детали, выделить границы, сделать надписи, составить новые изображения из фрагментов старых и т.п. На полученном изображении можно проводить любые измерения с автоматической регистрацией результатов. При повторении одних и тех же манипуляций (либо при рутинных измерениях) достаточно составить необходимый алгоритм операций - статистическую обработку результатов компьютер произведет самостоятельно.

В световых микроскопах предусмотрена возможность установки дополнительных принадлежностей, предназначенных для:

улучшения условий работы (например, препаратоводитель, бинокулярная насадка, насадки для фото- и видеосъёмки);

измерения и подсчета (объект-микрометры, окулярные микрометры, окуляры со вставными сетками);

расширения функциональных возможностей микроскопа (например , к онденсоры косого освещения и тёмного поля, фазово-контрастные устройства, оптические светофильтры, съёмный люминесцентный осветитель).

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм.

Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.

Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива -интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.

Методы световой микроскопии

Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля и его разновидности

Метод тёмного поля в проходящем свете (Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции - т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Проведение темнопольного исследования

Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:

Устанавливают свет по Келеру;
Заменяют светлопольный конденсор темнопольным;
На верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;
Поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;
Объектив малого увеличения фокусируют на препарат;
С помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);
Поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна.

Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц с×частиц размером до 2×10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

Метод фазового контраста

Метод фазового контраста и его разновидность - т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:

Набора объективов со специальными фазовым пластинками;
Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;
Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.

Настройка фазового контраста заключается в следующем:

Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph) ;
Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "0");
Настраивают свет по Келеру;
Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;
Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;
Вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный телескоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный телескоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху.

– это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста – это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров.

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен - возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.